Phage تطبيق العلاج لمواجهة Pseudomonas aeruginosa العدوى في التليف الكيسي حمار وحشي أجنة
Summary
قدم هنا هو بروتوكول لSeds pseudomonas aeruginosa العدوى والعلاج phage التطبيق في التليف الكيسي (CF) أجنة حمار وحشي.
Abstract
إن مقاومة مضادات الميكروبات، وهي نتيجة رئيسية لعدم اليقين التشخيصي والإفراط في وصف مضادات الميكروبات، هي سبب معترف به بشكل متزايد للعدوى الحادة والمضاعفات والوفيات في جميع أنحاء العالم مع تأثير كبير على مجتمعنا وعلى النظام الصحي. على وجه الخصوص ، يخضع المرضى الذين يعانون من نقص في جهاز المناعة أو الأمراض المزمنة والمزمنة الموجودة من قبل ، مثل التليف الكيسي (CF) ، لعلاجات المضادات الحيوية المتكررة للسيطرة على العدوى مع ظهور وعزل المقاومات متعددة الأدوية. ولذلك، هناك حاجة ملحة لمعالجة العلاجات البديلة لمواجهة العدوى البكتيرية. استخدام البكتيريا، أعداء الطبيعية للبكتيريا، يمكن أن يكون حلا ممكنا. البروتوكول مفصلة في هذا العمل يصف تطبيق العلاج phage ضد العدوى pseudomonas aeruginosa في الأجنة حمار وحشي CF. أصيبت أجنة حمار وحشي مع P. aeruginosa لإثبات أن العلاج phage فعالة ضد العدوى P. aeruginosa كما أنه يقلل من الفتك, العبء البكتيري والاستجابة المناعية الموالية للالتهابات في الأجنة CF.
Introduction
العلاج Phage، واستخدام الأعداء الطبيعية للبكتيريا لمكافحة الالتهابات البكتيرية، هو كسب تجدد الاهتمام كما المقاومة البكتيرية للمضادات الحيوية يصبح على نطاق واسع1،2. هذا العلاج، وتستخدم لعقود في أوروبا الشرقية، يمكن اعتبار العلاج التكميلي للمضادات الحيوية في علاج التهابات الرئة في المرضى الذين يعانون من CF، ويمكن أن يكون بديلا علاجيا للمرضى المصابين بالبكتيريا التي تقاوم جميع المضادات الحيوية المستخدمة حاليا2،3. مزايا العلاج بالمضادات الحيوية هي أن البكتيريا تتكاثر في موقع العدوى ، في حين يتم استقلاب المضادات الحيوية والقضاء عليها من الجسم4،5. في الواقع ، وقد ثبت أن إدارة الكوكتيلات من phages ضراوة معزولة في مختبرات مختلفة لتكون فعالة في علاج العدوى pseudomonas aeruginosa في نماذج مختلفة مثل الحشرات والثدييات6،7،8. كما تبين أن العلاج Phage تكون قادرة على الحد من العبء البكتيري في حرق الجروح المصابة P. aeruginosa وEscherichia القولونية في التجارب السريرية العشوائية9.
وقد برز حمار وحشي(Danio rerio)مؤخرا كنموذج قيمة لدراسة الالتهابات مع العديد من مسببات الأمراض، بما في ذلك P. aeruginosa10،11، الخراج ميكروباكتيريا وبوركولديريا سيباسيا12،13. بواسطة microinject البكتيريا مباشرة في الدورة الدموية الجنين14 فمن السهل إنشاء عدوى الجهازية التي يتم التصدي لها من قبل نظام المناعة الفطرية حمار وحشي، الذي هو التطورية المحفوظة مع العدلات وتوليد الضامة مماثلة لنظير الإنسان. وعلاوة على ذلك، خلال الشهر الأول من الحياة، تفتقر أجنة الحمار الوحشي إلى الاستجابة المناعية التكيفية، مما يجعلها نماذج مثالية لدراسة المناعة الفطرية، وهي آلية الدفاع الحرجة في التهابات الرئة البشرية15. ظهرت مؤخرا حمار وحشي كنظام نموذج وراثي قوي لفهم أفضل للCF بداية وتطوير علاجات الدوائية جديدة10,16,17. نموذج CF حمار وحشي من cftr الضربة القاضية إلى أسفل ولدت مع حقن مورفولينو في حمار وحشي قدم استجابة انفجار الجهاز التنفسي المثبطة وانخفاض الهجرة العدلات10, في حين أن CFTR خروج المغلوب يؤدي إلى ضعف موقف الجهاز الداخلي وتدمير البنكرياس exocrine, النمط الظاهري الذي يعكس المرض البشري16,17. وكان من أهم ما يثير الاهتمام هو أن عبء البكتيريا P. aeruginosa كان أعلى بكثير في cftr-فقدانمن وظيفة الأجنة مما كانت عليه في الضوابط في 8 ساعات بعد العدوى (hpi), الذي يوازي النتائج التي تم الحصول عليها مع الفئران والخلايا الظهارية القصباتية البشرية2,18.
في هذا العمل، ونحن نثبت أن العلاج phage فعالة ضد العدوى P. aeruginosa في أجنة سمك الحمار الوحشي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المخطوطة، وصفنا البروتوكول الخاص بإجراء عدوى P. aeruginosa (PAO1) في أجنة أسماك الحمار الوحشي وكيفية تطبيق العلاج بالفسيج مع مزيج من الففاج التي تم تحديدها سابقًا على أنها قادرة على إصابة PAO1 لحلها. استخدام البكتيريا كبديل للعلاج بالمضادات الحيوية كان من الاهتمام المتزايد منذ السنوات ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل مؤسسة التليف الكيسي الإيطالي (FFC#22/2017; Associazione “Gli amici della Ritty” Casnigo و FFC #23/2019؛ Un respiro في piû Onlus La Mano tesa Onlus).
Materials
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
| Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
| Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
| Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
| Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
| N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
| Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
| Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |
References
- Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
- Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).
- Pacios, O., et al. Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases. Antibiotics. 9 (2), 65 (2020).
- Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae. Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).
- Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients. Burns. 32 (5), 644-656 (2006).
- Heo, Y. J., et al. Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646 (2009).
- McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028 (2007).
- Forti, F., et al. Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573 (2018).
- Jault, P., et al. Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial. Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).
- Clatworthy, A. E., et al. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).
- Bernut, A., et al. CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses. Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).
- Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Doring, G., Gulbins, E. Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease. Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).
- Navis, A., Bagnat, M. Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish. Developmental Biology. 399, 237-248 (2015).
- Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer’s vesicle in zebrafish. Development. 140, 1703-1712 (2013).
- Balloy, V., et al. Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns. PLoS One. 10, 0140979 (2015).
- Cafora, M., et al. Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model. Science Reports. 9, 1527 (2019).
- Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction. Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).
- Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).
