Faagtherapie toepassing om pseudomonas aeruginosa infectie tegen te gaan in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryo's
Summary
Hier gepresenteerd is een protocol voor Pseudomonas aeruginosa infectie en faagtherapie toepassing in cystische fibrose (CF) zebravis embryo’s.
Abstract
Antimicrobiële resistentie, een belangrijk gevolg van diagnostische onzekerheid en antimicrobiële overprescriptie, is een steeds meer erkende oorzaak van ernstige infecties, complicaties en sterfte wereldwijd met een enorme impact op onze samenleving en op het gezondheidssysteem. In het bijzonder worden patiënten met een gecompromitteerd immuunsysteem of reeds bestaande en chronische pathologieën, zoals cystische fibrose (CF), onderworpen aan frequente antibioticabehandelingen om de infecties te beheersen met het verschijnen en verspreiden van multiresistente isolaten. Daarom is er een dringende noodzaak om alternatieve therapieën aan te pakken om bacteriële infecties tegen te gaan. Het gebruik van bacteriofagen, de natuurlijke vijanden van bacteriën, kan een mogelijke oplossing zijn. Het protocol dat in dit werk wordt beschreven, beschrijft de toepassing van faagtherapie tegen Pseudomonas aeruginosa-infectie in CF-zebravisembryo’s. Zebravis embryo’s werden besmet met P. aeruginosa om aan te tonen dat faagtherapie effectief is tegen P. aeruginosa infecties als het vermindert letaliteit, bacteriële last en pro-inflammatoire immuunrespons in CF embryo’s.
Introduction
Faagtherapie, het gebruik van de natuurlijke vijanden van bacteriën om bacteriële infecties te bestrijden, is garnering hernieuwde belangstelling als bacteriële resistentie tegen antibiotica wordt wijdverbreid1,2. Deze therapie, die al tientallen jaren in Oost-Europa wordt gebruikt, kan worden beschouwd als een aanvullende behandeling van antibiotica bij het genezen van longinfecties bij patiënten met CF en een mogelijk therapeutisch alternatief voor patiënten die besmet zijn met bacteriën die resistent zijn tegen alle antibiotica die momenteel in gebruik zijn2,3. Voordelen van antibioticatherapie zijn dat bacteriofagen zich vermenigvuldigen op de besmettingsplaats, terwijl antibiotica worden gemetaboliseerd en uit het lichaam worden geëlimineerd4,5. De toediening van cocktails van virulente fagen die geïsoleerd zijn in verschillende laboratoria heeft bewezen effectief te zijn bij de behandeling van Pseudomonas aeruginosa-infecties in diermodellen zo verschillend als insecten en zoogdieren6,7,8. Faagtherapie bleek ook in staat te zijn om de bacteriële belasting in brandwonden besmet met P. aeruginosa en Escherichia coli te verminderen in een gerandomiseerde klinische studie9.
Zebravis (Danio rerio) is onlangs naar voren gekomen als een waardevol model om infecties met verschillende ziekteverwekkers te bestuderen, waaronder P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus en Burkolderia cepacia12,13. Door bacteriën rechtstreeks in de embryobloedcirculatie14 te microinjecteren is het gemakkelijk om een systemische infectie op te zetten die wordt tegengegaan door het aangeboren immuunsysteem van zebravissen, dat evolutionair wordt geconserveerd met neutrofielen en macrofaaggeneratie vergelijkbaar met de menselijke tegenhanger. Bovendien, tijdens de eerste maand van het leven, zebravis embryo’s missen de adaptieve immuunrespons, waardoor ze ideale modellen voor het bestuderen van de aangeboren immuniteit, dat is de kritische afweermechanisme bij menselijke longinfecties15. Zebravissen ontpopten zich onlangs als een krachtig genetisch modelsysteem om het cf-begin beter te begrijpen en nieuwe farmacologische behandelingen te ontwikkelen10,16,17. Het CF zebrafish model van cftr knock-down gegenereerd met morpholino injectie in zebravissen presenteerde een gedempte ademhalingsuitbarsting respons en verminderde neutrofiele migratie10, terwijl de cftr knock-out leidt tot verminderde interne orgaanpositie en de vernietiging van de exocrine alvleesklier, een fenotype dat de menselijke ziekteweerspiegelt 16,17. Van het grootste belang was de bevinding dat de P. aeruginosa bacteriële last aanzienlijk hoger was in cftr-loss-of-function embryo’s dan in controles op 8 uur na infectie (hpi), die parallel loopt met de resultaten verkregen met muizen en menselijke bronchiale epitheliale cellen2,18. cftr
In dit werk tonen we aan dat faagtherapie effectief is tegen P. aeruginosa infecties in zebravis embryo’s.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit manuscript beschreven we het protocol om P. aeruginosa (PAO1) infectie uit te voeren in zebravisembryo’s en hoe faagtherapie toe te passen met een cocktail van fagen die eerder was geïdentificeerd als in staat om PAO1 te infecteren om het op te lossen. Het gebruik van bacteriofagen als alternatief voor antibioticabehandelingen is de laatste jaren steeds meer in het oog. Dit is voornamelijk te wijten aan de verspreiding van multiresistente (MDR) bacteriële infecties, die een ernstig probleem vormen voor …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Italiaanse Cystic Fibrosis Foundation (FFC#22/2017; Associazione “Gli amici della Ritty” Casnigo en FFC#23/2019; Un respiro in più Onlus La Mano tesa Onlus).
Materials
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
| Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
| Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
| Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
| Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
| N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
| Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
| Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |
References
- Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
- Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).
- Pacios, O., et al. Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases. Antibiotics. 9 (2), 65 (2020).
- Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae. Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).
- Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients. Burns. 32 (5), 644-656 (2006).
- Heo, Y. J., et al. Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646 (2009).
- McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028 (2007).
- Forti, F., et al. Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573 (2018).
- Jault, P., et al. Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial. Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).
- Clatworthy, A. E., et al. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).
- Bernut, A., et al. CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses. Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).
- Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Doring, G., Gulbins, E. Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease. Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).
- Navis, A., Bagnat, M. Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish. Developmental Biology. 399, 237-248 (2015).
- Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer’s vesicle in zebrafish. Development. 140, 1703-1712 (2013).
- Balloy, V., et al. Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns. PLoS One. 10, 0140979 (2015).
- Cafora, M., et al. Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model. Science Reports. 9, 1527 (2019).
- Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction. Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).
- Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).
