תרבות של פריציטים נומי מוח למדידות סידן ציטוסולית מחקרי הדמיית סידן
Summary
pericytes נימי המוח הם שחקנים חיוניים ברגולציה של תכונות מחסום דם – מוח וזרימת דם. פרוטוקול זה מתאר כיצד pericytes נימות המוח יכול להיות מבודד, תרבותי, מאופיין ביחס לסוג התא והגיש בקשה לחקירות של סידן תאי איתות עם בדיקות פלורסנט.
Abstract
Pericytes קשורים עם תאים אנדותל ו endfeet אסטרוציטים במבנה המכונה היחידה הנוירוסקולרית (NVU). תפקוד פריציט נמת המוח אינו ידוע במלואו. Pericytes הוצעו להיות מעורבים בפיתוח נימי, רגולציה של מחסום אנדותל ופעילות trancytosis, רגולציה של טון נימי ולשחק תפקידים מכריעים בפתולוגיות מוח מסוימות.
Pericytes מאתגרים לחקור במוח שלם בשל הקשיים בהדמיה תהליכים parenchyma במוח, כמו גם את הקרבה לתאים האחרים של NVU. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לבידוד ותרבות של pericytes נימות המוח הראשי של המוח של פר והשימוש הבא שלהם במחקרי הדמיית סידן, שבו ניתן לחקור השפעות של אגוניסטים המעורבים איתות מוחי ופתולוגיות. שברי נימים קליפתיים מותר לצרף לתחתית מבחנות תרבות, ולאחר 6 ימים, תאים אנדותל וpericytes גדלו מתוך שברי נימים. תאי אנדותל מוסרים על ידי טריפסינוזציה עדינה pericytes הם תרבותיים במשך 5 ימים נוספים לפני המעבר.
pericytes מבודד נזרעים 96-well צלחות תרבות טעון עם צבע מחוון סידן (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) כדי לאפשר מדידות של רמות סידן תאי בהגדרת קורא צלחת. לחלופין, pericytes הם זרעים על כיסויים רכוב בתאי תא. לאחר טעינה עם מחוון הסידן (Cal-520 AM), סידן חי הדמיה יכול להתבצע באמצעות מיקרוסקופ confocal באורך גל העירור של 488 nm ואורך גל פליטה של 510-520 נה”מ.
השיטה המתוארת כאן שימשה כדי להשיג את מדידות סידן תאי הראשון מpericytes המוח הראשי, המוכיח כי pericytes מגורה באמצעות ATP והם מסוגלים להתכווץ במבחנה.
Introduction
פריציטים נימי המוח, יחד עם תאים אנדותל ואסטרוציטים, מהווים NVU1,2,3. תאי אנדותל, אשר מהווים את הבסיס המבני של הנימים, יוצרים צינורות גליליים ארוכים בקוטר של 5-8 μm. תאי ה אנדותל מכוסים באופן אקראי בpericytes ומוקפים בולטות של אסטרוקיטים; כפות החיים של האסטרוציט.
מחסום הדם – מוח (BBB), ממוקם נימים במוח, הוא האתר העיקרי להחלפת חומרים מזינים, גזים ומוצרי פסולת בין המוח והדם. BBB גם מגן על המוח מפני רעלנים עצביים אנדוגניים אקסוגניים ומשמש כמחסום למסירה של מספר רב של תרכובות סמים. פונקציית המחסום היא אזור מיקוד, כמו גם מכשול, עבור חברות תרופות המפתחות תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS). זה עורר עניין רב בחקירת התאים של NVU בתרבות4. אסטרוקטים במוח ותאי אנדותל כבר תרבותיים ומאופיין במספר מחקרים, בעוד המחקרים והפרוטוקולים לתרבות pericyte הם שונים.
פרוטוקולים שפורסמו בעבר תיארו דור של תרבויות פריציט נימו המוח במידה מסוימת, באמצעות מגוון של גישות שונות כגון אימונופנינג5, מדיה גבוהה ונלוכה גלוקוז6, פלואורסצנט מופעל תאמיון 7, צנטריפוגההדרגתית צפיפות 8, וכו ‘. למרות ששיטות אלה נראות מספיקות כדי להשיג תרבויות של פריציטים, חלקן גוזלות זמן, בעלות יקרה והפריקיטים שהושגו לא יהיו אידיאליים בשל מספר מעברי התרבות שיכולים להבדיל בין ה pericytes9. יתר על כן, הפוטנציאל של pericytes מתורא במבחנה איתות מחקרים כבר די לא נחקר עד עכשיו.
העבודה הנוכחית מתמקדת בדור של תרביות פריציט מנימים מבודדים של מוח בקר וההגדרה הבאה למדידות ולחקרי הדמיה של שינויים בסידן תאי, שליח שני תאי חשוב. אנו מתארים בקצרה את הבידוד של נימים מחמר אפור קליפתי (לפרטים ראו הלמס ואח’10)ואת הבידוד והתרבות של pericytes במונוקולטורה טהורה ללא זיהום עם תאים אנדותל או גליה. לאחר מכן אנו מספקים פרוטוקול ל זריעת pericytes ב 96-באר צלחות וטעינת פרוטוקולים עבור גשושית סידן Fura-2 AM. לבסוף, אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בפריציטים בהדמיה קונפוקלית בזמן אמת בחדרי תרבות מיקרוסקופ ומתארים את הפרוטוקולים לכך.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, אנו הציגו שיטה לבודד pericytes ראשוני ממוחות של קבר. הפרוטוקול המתואר מאפשר תרבות מסוג תא זה, שאחרת אינו נגיש. תרבות התא שהושגה לאחר מכן הייתה אוכלוסייה כמעט הומוגנית של pericytes, עם זיהום קטן או ללא עם תאים אנדותל ותאי גליה המבוססים על מורפולוגיה של תאים וביטויחלבון 12. יתר על…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר במימון מיוזמת המחקר של קרן לונדבק על מחסומי מוח ואספקת סמים (RIBBDD) וקרן משפחת סיימון הוגר.
Materials
| ATP | Tocris | 3245 | |
| Cal-520 AM | AAT Bioquest | 21130 | |
| Cell incubator | Thermo Fisher | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Multifuge 3SR+ | Standard large volume centrifuge for spinning down cells |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | Zeiss LSM 510 | Inverted microscope |
| Counting chamber | FastRead | 102 | |
| Coverslip cell chamber | Airekacells | SC15022 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | C5135 | Formerly known as Kolliphor EL |
| DMSO | Sigma Aldrich | 471267 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium | Sigma Aldrich | D0819 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA/GE Healthcare | A15-101 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fisher | F1201 | |
| Glass coverslips 22×22 mm | VWR International | 631-0123 | |
| HBSS | Gibco | 14065-049 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| HEPES | AppliChem Panreac | A1069 | |
| Light microscope | Olympus | Olympus CK2 | Upright light microscope with phase contrast |
| MEM nonessential amino acids | Sigma Aldrich | M7145 | |
| Microplate Reader | BMG LabTech | NOVOstar | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | Phosphate-buffered saline |
| penicillin G sodium/streptomycin sulfate | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Pluronic F127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4299 | |
| T-75 flask | Sigma Aldrich | CLS3972 | |
| 96-well plate | Corning incorporated | 3603 |
References
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).
- Liu, G. H., et al. Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats. Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).
- Nayak, R. C., Herman, I. M. Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification. Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).
- Nees, S., et al. Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).
- Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. Endothelial/pericyte interactions. Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).
- Helms, H. C., Brodin, B., Milner, R. Methods in Molecular Biology. Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. 1135, 365-382 (2014).
- Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. Purinergic signalling in the nervous system: an overview. Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).
- Cai, C., et al. Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries. PNAS. , (2018).
- Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).
- Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes. Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).
- Orlidge, A., Damore, P. A. Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components. Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).
- Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).
- Bintig, W., et al. Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3. Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).
- Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
- Kamouchi, M., et al. Calcium influx pathways in rat CNS pericytes. Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).
- Das, A., et al. ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro. Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).
