Cultura de Pericytes Capilares Cerebrais para Medições citosóicas de cálcio e estudos de imagem de cálcio
Summary
Pericytes capilares cerebrais são atores essenciais na regulação das propriedades da barreira hemencefálica e do fluxo sanguíneo. Este protocolo descreve como pericytos capilares cerebrais podem ser isolados, cultivados, caracterizados em relação ao tipo celular e aplicados para investigações de sinalização intracelular de cálcio com sondas fluorescentes.
Abstract
Os pericítos estão associados com células endoteliais e pés de extremidade astrócito em uma estrutura conhecida como unidade neurovascular (NVU). A função de pericyte capilar cerebral não é totalmente conhecida. Os pericítos têm sido sugeridos para estarem envolvidos no desenvolvimento capilar, regulação do aperto da barreira endotelial e da atividade de trancostose, regulação do tom capilar e para desempenhar papéis cruciais em certas patologias cerebrais.
Os pericítos são desafiadores para investigar no cérebro intacto devido às dificuldades em visualizar processos no parenchyma cerebral, bem como a proximidade com as outras células da NVU. O presente protocolo descreve um método de isolamento e cultura de pericytes capilares cerebrais bovinos primários e seu uso seguinte em estudos de imagem de cálcio, onde os efeitos de agonistas envolvidos na sinalização cerebral e patologias podem ser investigados. Fragmentos capilares corticais são permitidos a anexar-se ao fundo dos frascos de cultura e, após 6 dias, células endoteliais e pericítos cresceram a partir dos fragmentos capilares. As células endoteliais são removidas por trippsinização suave e os pericítos são cultivados por 5 dias adicionais antes da passagem.
Pericítos isolados são semeados em placas de cultura de 96 poços e carregados com o corante indicador de cálcio (Fura-2 acetoximethyl (AM)) para permitir medidas de níveis intracelulares de cálcio em uma configuração de leitor de placas. Alternativamente, os pericílitos são semeados em tampas e montados em câmaras de células. Após o carregamento com o indicador de cálcio (Cal-520 AM), a imagem viva de cálcio pode ser realizada usando microscopia confocal em um comprimento de onda de excitação de 488 nm e comprimento de onda de emissão de 510-520 nm.
O método descrito aqui tem sido usado para obter as primeiras medidas intracelulares de cálcio a partir de pericytes capilares cerebrais primários, demonstrando que os pericítos são estimulados via ATP e são capazes de contrair in vitro.
Introduction
Pericytes capilares cerebrais, juntamente com células endoteliais e astrócitos, constituem a NVU1,2,3. As células endoteliais, que formam a base estrutural dos capilares, formam tubos cilíndricos longos com diâmetro de 5-8 μm. As células endoteliais são esporadicamente cobertas com pericitos e cercadas por saliências de astrócitos; o astrócito endfee.
A barreira hemencefálica (BBB), situada nos capilares cerebrais, é o principal local de troca de nutrientes, gases e resíduos entre o cérebro e o sangue. O BBB também protege o cérebro de neurotoxinas endógenas e exógenas e serve como uma barreira para a entrega de um grande número de compostos medicamentosos. A função barreira é uma área de foco, bem como um obstáculo, para as empresas farmacêuticas que desenvolvem medicamentos do Sistema Nervoso Central (SNC). Isso estimulou um grande interesse em investigar as células da NVU na cultura4. Astrócitos cerebrais e células endoteliais foram cultivados e caracterizados em uma série de estudos, enquanto os estudos e protocolos para a cultura pericíte são escassos.
Protocolos publicados anteriormente descreveram a geração de culturas de pericíte capilares cerebrais até certo ponto, usando uma gama de diferentes abordagens, como imunopanning5,mídia de alta e baixa glicose6,classificação celular ativada por fluorescentes7,centrifugação gradiente de densidade8,etc. Embora esses métodos pareçam suficientes para obter culturas de pericítos, alguns são demorados, custam caro e os pericítos obtidos podem não ser ideais devido ao número de passagens culturais que podem deseleg diferenciar os pericítes9. Além disso, o potencial de pericítos cultivados em estudos de sinalização in vitro tem sido bastante inexplorado até agora.
O presente trabalho se concentra na geração de culturas pericíte de capilares cerebrais bovinos isolados e na configuração subsequente para medições e estudos de imagem de alterações no cálcio intracelular, um importante mensageiro intracelular. Descrevemos brevemente o isolamento dos capilares da matéria cinzenta cortical (para detalhes ver Helms et al.10) e o isolamento e cultura de pericílitos em monocultura pura sem contaminação com células endoteliais ou gliais. Em seguida, fornecemos um protocolo para semeadura de pericítos em placas de 96 poços e protocolos de carregamento para a sonda de cálcio Fura-2 AM. Finalmente, mostramos como os pericítos podem ser usados em imagens confocal em tempo real em câmaras de cultura de microscópio e descrevemos os protocolos para isso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, apresentamos um método para isolar pericítos primários de cérebros bovinos. O protocolo descrito permite a cultura desse tipo de célula bastante inacessível. A cultura celular posteriormente obtida foi uma população quase homogênea de pericítos, com pouca ou nenhuma contaminação com células endoteliais e células gliais baseadas na morfologia celular e expressão proteica12. Além disso, demonstramos um método simples e simples para carregar os pericítos com corantes d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores desejam reconhecer o financiamento da iniciativa de Pesquisa da Fundação Lundbeck sobre Barreiras Cerebrais e Entrega de Drogas (RIBBDD) e da Fundação Da Família Simon Hougners.
Materials
| ATP | Tocris | 3245 | |
| Cal-520 AM | AAT Bioquest | 21130 | |
| Cell incubator | Thermo Fisher | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Multifuge 3SR+ | Standard large volume centrifuge for spinning down cells |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | Zeiss LSM 510 | Inverted microscope |
| Counting chamber | FastRead | 102 | |
| Coverslip cell chamber | Airekacells | SC15022 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | C5135 | Formerly known as Kolliphor EL |
| DMSO | Sigma Aldrich | 471267 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium | Sigma Aldrich | D0819 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA/GE Healthcare | A15-101 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fisher | F1201 | |
| Glass coverslips 22×22 mm | VWR International | 631-0123 | |
| HBSS | Gibco | 14065-049 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| HEPES | AppliChem Panreac | A1069 | |
| Light microscope | Olympus | Olympus CK2 | Upright light microscope with phase contrast |
| MEM nonessential amino acids | Sigma Aldrich | M7145 | |
| Microplate Reader | BMG LabTech | NOVOstar | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | Phosphate-buffered saline |
| penicillin G sodium/streptomycin sulfate | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Pluronic F127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4299 | |
| T-75 flask | Sigma Aldrich | CLS3972 | |
| 96-well plate | Corning incorporated | 3603 |
References
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