Kultur der Hirnkapillarpericyten für zytosolische Kalziummessungen und Calcium-Imaging-Studien
Summary
Gehirn Kapillarpericyten sind wesentliche Akteure bei der Regulierung der Blut – Hirn-Schranke Eigenschaften und Blutfluss. Dieses Protokoll beschreibt, wie Kapillarperizyten des Gehirns isoliert, kultiviert, in Bezug auf den Zelltyp charakterisiert und für Untersuchungen der intrazellulären Calciumsignalisierung mit fluoreszierenden Sonden angewendet werden können.
Abstract
Pericyte werden mit Endothelzellen und astrozytischen Endfüßen in einer Struktur assoziiert, die als neurovaskuläre Einheit (NVU) bekannt ist. Gehirn Kapillarperizytenfunktion ist nicht vollständig bekannt. Pericyten wurden vorgeschlagen, an der Kapillarentwicklung, der Regulierung der Endothelbarrieredichtheit und Tranzytoseaktivität, der Regulierung des Kapillartons beteiligt zu sein und bei bestimmten Hirnpathologien eine entscheidende Rolle zu spielen.
Perizyten sind eine Herausforderung, im intakten Gehirn aufgrund der Schwierigkeiten bei der Visualisierung von Prozessen im Gehirn Parenchym zu untersuchen, sowie die Nähe zu den anderen Zellen der NVU. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultur von primären Rinderhirnkapillarperizyten und deren anschließende Verwendung in Kalzium-Bildgebungsstudien, bei denen Die Wirkung von Agonisten, die an der Signalisierung des Gehirns und Pathologien beteiligt sind, untersucht werden kann. Kortikale Kapillarfragmente dürfen sich an den Boden von Kulturkolben anheften und nach 6 Tagen sind Endothelzellen und Pericyten aus den Kapillarfragmenten herausgewachsen. Die Endothelzellen werden durch sanfte Trypsinisierung entfernt und Pericyten werden für 5 weitere Tage vor dem Passieren kultiviert.
Isolierte Pericyte werden in 96-Well-Kulturplatten gesät und mit dem Calciumindikatorfarbstoff (Fura-2 Acetoxymethyl (AM)) beladen, um Messungen des intrazellulären Kalziumspiegels in einem Plattenleser-Setup zu ermöglichen. Alternativ werden Pericyte auf Coverlips gesät und in Zellkammern montiert. Nach der Belastung mit dem Kalziumindikator (Cal-520 AM) kann die Calcium-Live-Imaging mittels konfokaler Mikroskopie bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 510-520 nm durchgeführt werden.
Die hier beschriebene Methode wurde verwendet, um die ersten intrazellulären Kalziummessungen aus primären Hirnkapillarperizyten zu erhalten, die zeigen, dass Pericyte über ATP stimuliert werden und sich in vitro zusammenziehen können.
Introduction
Hirnkapillarpericyten bilden zusammen mit Endothelzellen und Astrozyten die NVU1,2,3. Die Endothelzellen, die die strukturelle Basis der Kapillaren bilden, bilden lange zylindrische Rohre mit einem Durchmesser von 5-8 m. Die Endothelzellen sind sporadisch mit Pericyten bedeckt und von Vorsprüngen von Astrozyten umgeben; die Astrozyten-Endfüße.
Die Blut-Hirn-Schranke (BBB), die sich an den Hirnkapillaren befindet, ist der Hauptort für den Austausch von Nährstoffen, Gasen und Abfallprodukten zwischen Gehirn und Blut. Die BBB schützt auch das Gehirn vor endogene und exogene Neurotoxine und dient als Barriere für die Lieferung einer großen Anzahl von Wirkstoffverbindungen. Die Barrierefunktion ist ein Schwerpunktbereich und ein Hindernis für Pharmaunternehmen, die Medikamente des Zentralnervensystems (ZNS) entwickeln. Dies hat ein großes Interesse an der Untersuchung der Zellen der NVU in Kultur4geweckt. Hirnastrozyten und Endothelzellen wurden in einer Reihe von Studien kultiviert und charakterisiert, während die Studien und Protokolle für die Pericytkultur spärlich sind.
Zuvor veröffentlichte Protokolle haben die Erzeugung von hirnkapillaren Pericytenkulturen bis zu einem gewissen Grad beschrieben, mit einer Reihe von verschiedenen Ansätzen wie Immunpanning5, High- und Low-Glucose-Medien6, fluoreszierend-aktivierte Zellsortierung7, Gradient zentrifugation8, etc. Obwohl diese Methoden ausreichen, um Kulturen von Pericyten zu erhalten, sind einige zeitaufwändig, kostenteuer und die erhaltenen Pericyten sind aufgrund der Anzahl der Kulturpassagen, die die Pericyten dedifferenzieren können, möglicherweise nichtideal. Darüber hinaus ist das Potenzial kultivierter Pericyten in In-vitro-Signalisierungsstudien bisher ziemlich unerforscht.
Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Erzeugung von Pericytkulturen aus isolierten Rinderhirnkapillaren und die anschließende Einrichtung von Messungen und bildgebenden Studien von Veränderungen des intrazellulären Kalziums, einem wichtigen intrazellulären zweiten Botenstoff. Wir beschreiben kurz die Isolierung von Kapillaren von kortikaler Graumaterie (Details siehe Helms et al.10) und die Isolation und Kultur von Pericyten in reiner Monokultur ohne Kontamination mit endothelialen oder glialen Zellen. Wir liefern dann ein Protokoll für die Aussaat von Pericyten in 96-Well-Platten und Ladeprotokolle für die Kalziumsonde Fura-2 AM. Schließlich zeigen wir, wie Pericyte in Echtzeit konfokale Bildgebung in Mikroskopkulturkammern verwendet werden können und beschreiben die Protokolle dafür.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie haben wir eine Methode vorgestellt, um primäre Pericyten von Rinderhirnen zu isolieren. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Kultur dieses ansonsten nicht zugänglichen Zelltyps. Die später erhaltene Zellkultur war eine nahezu homogene Population von Pericyten, mit wenig oder gar keiner Kontamination mit Endothelzellen und Gliazellen auf Der Grundlage von Zellmorphologie und Proteinexpression12. Darüber hinaus haben wir eine einfache und einfache Methode zum Beladen der P…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die Förderung durch die Lundbeck Foundation Research Initiative on Brain Barriers and Drug Delivery (RIBBDD) und die Simon Hougners Family Foundation würdigen.
Materials
| ATP | Tocris | 3245 | |
| Cal-520 AM | AAT Bioquest | 21130 | |
| Cell incubator | Thermo Fisher | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Multifuge 3SR+ | Standard large volume centrifuge for spinning down cells |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | Zeiss LSM 510 | Inverted microscope |
| Counting chamber | FastRead | 102 | |
| Coverslip cell chamber | Airekacells | SC15022 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | C5135 | Formerly known as Kolliphor EL |
| DMSO | Sigma Aldrich | 471267 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium | Sigma Aldrich | D0819 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA/GE Healthcare | A15-101 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fisher | F1201 | |
| Glass coverslips 22×22 mm | VWR International | 631-0123 | |
| HBSS | Gibco | 14065-049 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| HEPES | AppliChem Panreac | A1069 | |
| Light microscope | Olympus | Olympus CK2 | Upright light microscope with phase contrast |
| MEM nonessential amino acids | Sigma Aldrich | M7145 | |
| Microplate Reader | BMG LabTech | NOVOstar | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | Phosphate-buffered saline |
| penicillin G sodium/streptomycin sulfate | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Pluronic F127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4299 | |
| T-75 flask | Sigma Aldrich | CLS3972 | |
| 96-well plate | Corning incorporated | 3603 |
References
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