Culture des péricytes capillaires cérébraux pour les mesures cytosoliques du calcium et les études d’imagerie calcique
Summary
Les péricytes capillaires cérébraux sont des acteurs essentiels dans la régulation des propriétés de la barrière céphalo-cérébrale et du flux sanguin. Ce protocole décrit comment les péricytes capillaires cérébraux peuvent être isolés, cultivés, caractérisés en ce qui concerne le type de cellule et appliqués pour des investigations de signalisation intracellulaire de calcium avec des sondes fluorescentes.
Abstract
Les péricytes sont associés aux cellules endothéliales et à l’endfeet astrocytique dans une structure connue sous le nom d’unité neurovasculaire (NVU). La fonction capillaire de pericyte de cerveau n’est pas entièrement connue. Des péricytes ont été suggérés pour être impliqués dans le développement capillaire, la régulation de l’étanchéité endothéliale de barrière et de l’activité de trancytosis, la régulation du tonus capillaire et pour jouer des rôles cruciaux dans certaines pathologies de cerveau.
Les péricytes sont difficiles à étudier dans le cerveau intact en raison des difficultés à visualiser les processus dans le parenchyme cérébral, ainsi que la proximité avec les autres cellules de l’INN. Le présent protocole décrit une méthode d’isolement et de culture des péricytes capillaires capillaires primaires du cerveau bovin et leur utilisation suivante dans les études d’imagerie calcique, où les effets des agonistes impliqués dans la signalisation cérébrale et les pathologies peuvent être étudiés. Les fragments capillaires corticals sont autorisés à s’attacher au fond des flacons de culture et, après 6 jours, les cellules endothéliales et les péricytes sont sortis des fragments capillaires. Les cellules endothéliales sont enlevées par trypsinisation douce et les péricytes sont cultivés pendant 5 jours supplémentaires avant de passer.
Les péricytes isolés sont ensemencés dans des plaques de culture de 96 puits et chargés du colorant indicateur de calcium (Fura-2 acéoxyméthyle (AM)) pour permettre des mesures des niveaux intracellulaires de calcium dans une configuration de lecteur de plaque. Alternativement, les péricytes sont ensemencés sur des coverslips et montés dans des chambres cellulaires. Après chargement avec l’indicateur de calcium (Cal-520 AM), la formation image vivante de calcium peut être exécutée utilisant la microscopie confocale à une longueur d’onde d’excitation de 488 nm et la longueur d’onde d’émission de 510-520 nm.
La méthode décrite ici a été utilisée pour obtenir les premières mesures intracellulaires de calcium à partir de péricytes capillaires cérébraux primaires, démontrant que les péricytes sont stimulés par ATP et sont capables de se contracter in vitro.
Introduction
Les péricytes capillaires cérébraux, ainsi que les cellules endothéliales et les astrocytes, constituent le NVU1,2,3. Les cellules endothéliales, qui forment la base structurelle des capillaires, forment de longs tubes cylindriques d’un diamètre de 5 à 8 μm. Les cellules endothéliales sont sporadiquement couvertes de péricytes et entourées de saillies d’astrocytes; l’endfeet d’astrocyte.
La barrière céphalo-encéphalique (BBB), située aux capillaires cérébraux, est le principal site d’échange de nutriments, de gaz et de déchets entre le cerveau et le sang. Le BBB protège également le cerveau contre les neurotoxines endogènes et exogènes et sert de barrière pour la livraison d’un grand nombre de composés médicamenteux. La fonction barrière est un domaine d’intérêt, ainsi qu’un obstacle, pour les compagnies pharmaceutiques qui développent des médicaments du système nerveux central (SNC). Cela a suscité un grand intérêt dans l’étude des cellules de l’OND dans la culture4. Les astrocytes cérébraux et les cellules endothéliales ont été cultivés et caractérisés dans un certain nombre d’études, tandis que les études et les protocoles pour la culture péricyte sont clairsemés.
Les protocoles précédemment édités ont décrit la génération des cultures capillaires de péricyte capillaire de cerveau dans une certaine mesure, utilisant une gamme de différentes approches telles que l’immunopannage5,les médias à haut et à faible glucose6,le tri cellulairefluorescent-activé 7,centrifugation de gradient dedensité 8,etc. Bien que ces méthodes semblent suffisantes pour obtenir des cultures de péricytes, certaines prennent beaucoup de temps, coûtent cher et les péricytes obtenus pourraient ne pas être idéales en raison du nombre de passages de culture qui peuvent différencier les péricytes9. En outre, le potentiel des péricytes cultivés dans les études de signalisation in vitro a été assez inexploré jusqu’à présent.
Les travaux actuels portent sur la génération de cultures péricyte à partir de capillaires cérébraux bovins isolés et sur la configuration subséquente pour les mesures et les études d’imagerie des changements dans le calcium intracellulaire, un deuxième messager intracellulaire important. Nous décrivons brièvement l’isolement des capillaires de la matière grise corticale (pour plus de détails voir Helms et coll.10)et l’isolement et la culture des péricytes en monoculture pure sans contamination par des cellules endothéliales ou gliales. Nous fournissons ensuite un protocole pour l’ensemencement des péricytes dans des plaques de 96 puits et des protocoles de chargement pour la sonde de calcium Fura-2 AM. Enfin, nous montrons comment les péricytes peuvent être utilisés en imagerie confocale en temps réel dans les chambres de culture au microscope et décrivons les protocoles pour cela.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, nous avons présenté une méthode pour isoler les péricytes primaires des cerveaux bovins. Le protocole décrit permet la culture de ce type de cellule autrement plutôt inaccessible. La culture cellulaire obtenue par la suite était une population presque homogène de péricytes, avec peu ou pas de contamination avec des cellules endothéliales et des cellules gliales basées sur la morphologie cellulaire et l’expression protéique12. En outre, nous avons démontré une mé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent souligner le financement de l’initiative de recherche de la Fondation Lundbeck sur les barrières cérébrales et la livraison de médicaments (RIBBDD) et de la Fondation de la famille Simon Hougners.
Materials
| ATP | Tocris | 3245 | |
| Cal-520 AM | AAT Bioquest | 21130 | |
| Cell incubator | Thermo Fisher | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Multifuge 3SR+ | Standard large volume centrifuge for spinning down cells |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | Zeiss LSM 510 | Inverted microscope |
| Counting chamber | FastRead | 102 | |
| Coverslip cell chamber | Airekacells | SC15022 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | C5135 | Formerly known as Kolliphor EL |
| DMSO | Sigma Aldrich | 471267 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium | Sigma Aldrich | D0819 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA/GE Healthcare | A15-101 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fisher | F1201 | |
| Glass coverslips 22×22 mm | VWR International | 631-0123 | |
| HBSS | Gibco | 14065-049 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| HEPES | AppliChem Panreac | A1069 | |
| Light microscope | Olympus | Olympus CK2 | Upright light microscope with phase contrast |
| MEM nonessential amino acids | Sigma Aldrich | M7145 | |
| Microplate Reader | BMG LabTech | NOVOstar | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | Phosphate-buffered saline |
| penicillin G sodium/streptomycin sulfate | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Pluronic F127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4299 | |
| T-75 flask | Sigma Aldrich | CLS3972 | |
| 96-well plate | Corning incorporated | 3603 |
References
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).
- Liu, G. H., et al. Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats. Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).
- Nayak, R. C., Herman, I. M. Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification. Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).
- Nees, S., et al. Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).
- Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. Endothelial/pericyte interactions. Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).
- Helms, H. C., Brodin, B., Milner, R. Methods in Molecular Biology. Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. 1135, 365-382 (2014).
- Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. Purinergic signalling in the nervous system: an overview. Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).
- Cai, C., et al. Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries. PNAS. , (2018).
- Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).
- Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes. Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).
- Orlidge, A., Damore, P. A. Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components. Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).
- Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).
- Bintig, W., et al. Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3. Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).
- Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
- Kamouchi, M., et al. Calcium influx pathways in rat CNS pericytes. Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).
- Das, A., et al. ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro. Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).
