Мозг капиллярных перицитов являются важными игроками в регуляции гемово-мозгового барьера свойства и кровотока. Этот протокол описывает, как перициты мозга могут быть изолированы, культурны, характеризуются по отношению к типу клеток и применяются для исследований внутриклеточного кальция сигнализации с флуоресцентными зондами.
Перициты связаны с эндотелиальными клетками и астроцитическим эндфитом в структуре, известной как нервно-сосудистый блок (NVU). Функция перицита мозга капилляра не до конца известна. Перициты были предложены для участия в развитии капилляров, регулирование эндотелиальной герметичности барьера и трансцитоза деятельности, регулирование капиллярного тона и играть решающую роль в некоторых патологий мозга.
Перициты являются сложными для исследования в нетронутой мозга из-за трудностей в визуализации процессов в мозге parenchyma, а также близость к другим клеткам NVU. Настоящий протокол описывает метод изоляции и культуры первичных капиллярных перицитов мозга крупного рогатого скота и их следующее использование в исследованиях визуализации кальция, где могут быть исследованы эффекты агонистов, участвующих в сигнализации мозга и патологиях. Корковые капиллярные фрагменты могут прикрепляться к нижней части культуры колбы и, после 6 дней, эндотелиальные клетки и перициты выросли из капиллярных фрагментов. Эндотелиальные клетки удаляются нежной трипсинизацией и перициты культурируются в течение 5 дополнительных дней до прохода.
Изолированные перициты посеяны в 96-колодец культуры пластин и загружены с красителем индикатор кальция (Fura-2 ацетоксиметил (AM)), чтобы для измерения внутриклеточного уровня кальция в установке считыватель пластин. Кроме того, перициты сеяются на крышках и устанавливаются в клеточных камерах. После загрузки с индикатором кальция (Cal-520 AM), кальций живой визуализации может быть выполнена с помощью конфокаляновой микроскопии на возбуждение длины волны 488 нм и выбросов длины волны 510-520 нм.
Метод, описанный здесь, был использован для получения первых внутриклеточных измерений кальция от первичных перицитов капилляров мозга, демонстрируя, что перициты стимулируются через АТФ и способны заключить контракт в пробирке.
Мозг капиллярных перицитов, вместе с эндотелиальными клетками и астроцитами, составляют NVU1,2,3. Эндотелиальные клетки, которые составляют структурную основу капилляров, образуют длинные цилиндрические трубки диаметром 5-8 мкм. Эндотелиальные клетки время от времени покрываются перицитами и окружены выступами астроцитов; эндфит астроцитов.
Гемово-мозговой барьер (BBB), расположенный в капиллярах мозга, является основным местом для обмена питательными веществами, газами и отходами между мозгом и кровью. BBB также защищает мозг от эндогенных и экзогенных нейротоксинов и служит барьером для доставки большого количества лекарственных соединений. Барьерная функция является областью фокусировки, а также препятствием для фармацевтических компаний, разрабатывая лекарства центральной нервной системы (ЦНС). Это вызвало большой интерес к расследованию клеток NVU в культуре4. Астроциты мозга и эндотелиальные клетки были культурны и охарактеризованы в ряде исследований, в то время как исследования и протоколы перицитной культуры являются редкими.
Ранее опубликованные протоколы описали генерации мозга капиллярных перицитных культур в некоторой степени, используя целый ряд различных подходов, таких какиммунопаннинг 5, высокой и низкой глюкозы СМИ 6 , флуоресцентно-активированнойклетки сортировки 7, плотность градиент центрифугации8и т.д. Хотя эти методы кажутся достаточными для получения культур перицитов, некоторые из них относят много времени, стоят дорого и перициты, полученные не может быть идеальным из-за числа культуры проходы, которые могутде-дифференцироватьpericytes 9 . Кроме того, потенциал культурных перицитов в исследованиях в области сигнализации in vitro до сих пор довольно не изучен.
Нынешняя работа посвящена генерации перицитовых культур из изолированных капилляров мозга крупного рогатого скота и последующей установке для измерений и исследований изображений изменений внутриклеточного кальция, важного внутриклеточного второго посланника. Мы кратко описываем изоляцию капилляров от коркового серого вещества (для деталей см. Helms et al.10)и изоляцию и культуру перицитов в чистой монокультуре без загрязнения эндотелиальными или глиальными клетками. Затем мы предоставляем протокол для посева перицитов в 96-хорошо пластин и протоколы загрузки для кальция зонд Fura-2 AM. Наконец, мы показываем, как перициты могут быть использованы в конфокальных изображений в режиме реального времени в камерах микроскопной культуры и описываем протоколы для этого.
В этом исследовании мы представили метод изоляции первичных перицитов от крупного рогатого скота. Описанный протокол позволяет культуре этого иначе довольно недоступный тип ячейки. Впоследствии полученная культура клеток была почти однородной популяцией перицитов, практически без ?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы отметить финансирование из Лундбек Фонд исследовательской инициативы по мозга барьеров и доставки наркотиков (RIBBDD) и Саймон Hougners семьи фонда.
ATP | Tocris | 3245 | |
Cal-520 AM | AAT Bioquest | 21130 | |
Cell incubator | Thermo Fisher | ||
Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Multifuge 3SR+ | Standard large volume centrifuge for spinning down cells |
Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | Zeiss LSM 510 | Inverted microscope |
Counting chamber | FastRead | 102 | |
Coverslip cell chamber | Airekacells | SC15022 | |
Cremophor EL | Sigma Aldrich | C5135 | Formerly known as Kolliphor EL |
DMSO | Sigma Aldrich | 471267 | |
Dulbecco's Modified Eagles Medium | Sigma Aldrich | D0819 | |
Fetal bovine serum (FBS) | PAA/GE Healthcare | A15-101 | |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
Fura-2 AM | Thermo Fisher | F1201 | |
Glass coverslips 22×22 mm | VWR International | 631-0123 | |
HBSS | Gibco | 14065-049 | |
Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
HEPES | AppliChem Panreac | A1069 | |
Light microscope | Olympus | Olympus CK2 | Upright light microscope with phase contrast |
MEM nonessential amino acids | Sigma Aldrich | M7145 | |
Microplate Reader | BMG LabTech | NOVOstar | |
PBS | Sigma Aldrich | D8537 | Phosphate-buffered saline |
penicillin G sodium/streptomycin sulfate | Sigma Aldrich | P0781 | |
Pluronic F127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4299 | |
T-75 flask | Sigma Aldrich | CLS3972 | |
96-well plate | Corning incorporated | 3603 |