Un ensayo de crecimiento de neurita y evaluación de neurotoxicidad con neuronas derivadas de células de progenitor neuronales humanos
Summary
El protocolo presentado describe un método para un ensayo de crecimiento de neurito y la evaluación de la neurotoxicidad de compuestos de moléculas pequeñas.
Abstract
El ensayo de crecimiento de la neurita y la evaluación de la neurotoxicidad son dos estudios principales que se pueden realizar utilizando el método presentado en el presente documento. Este protocolo proporciona un análisis fiable de la morfología neuronal junto con mediciones cuantitativas de modificaciones en la longitud de la neurita y la localización de proteínas sinápticas y abundancia en el tratamiento con compuestos de moléculas pequeñas. Además de la aplicación del método presentado en estudios de crecimiento de neuritas, se puede realizar una evaluación de la neurotoxicidad para evaluar, distinguir y clasificar los compuestos químicos comerciales en función de su posible efecto de neurotoxicidad del desarrollo.
A pesar de que las líneas celulares se utilizan hoy en día en ensayos de cribado compuestos en neurociencia, a menudo difieren genética y fenotípicamente de su origen tisular. Las células primarias, por otro lado, mantienen marcadores y funciones importantes observados in vivo. Por lo tanto, debido al potencial de traducción y la relevancia fisiológica que estas células podrían ofrecer un ensayo de crecimiento de neurita y la evaluación de la neurotoxicidad puede beneficiarse considerablemente del uso de células progenitoras neuronales humanas (hNPC) como el modelo de células humanas primarias.
El método presentado aquí se puede utilizar para detectar la capacidad de los compuestos para inducir el crecimiento de la neurita y la neurotoxicidad aprovechando las neuronas derivadas de células progenitoras neuronales humanas, un modelo celular que representa estrechamente la biología humana.”
Introduction
El crecimiento de la neurita es un proceso fundamental para la formación de la red neuronal y la regeneración nerviosa1,2. Después de una lesión, el crecimiento de la neurita juega un papel clave en la regeneración del sistema nervioso. El crecimiento de la neurita es también un elemento importante de la señalización extracelular en la inducción de actividades regenerativas neuronales para mejorar los resultados de los trastornos neurodegenerativos y lesiones neuronales3,,4,5,6.
Al mantener su potencial de diferenciación en la producción de varios linajes neuronales, las células progenitoras neuronales humanas (hNPC) podrían proporcionar un sistema modelo para los estudios de la función del sistema nervioso central (SNC) y el desarrollo7,,8,,9. El alto potencial traslacional y la relevancia fisiológica de los hNPC como modelo de células humanas primarias ofrecen una ventaja considerable en las pruebas de descubrimiento de fármacos relacionadas con el crecimiento de neuritas. Sin embargo, el mantenimiento y escalado de los modelos de células primarias para ensayos de alto rendimiento podría ser lento y laborioso10,,11,12,13.
Además de la aplicación del método presentado en estudios de crecimiento de neuritas, la evaluación de la neurotoxicidad es otra aplicación utilizando las neuronas derivadas de hNPC. Hay miles de compuestos químicos comerciales que no se examinan o con potencial de neurotoxicidad mal entendido. Por lo tanto, experimentos de cribado más fiables y eficaces para evaluar, distinguir y clasificar compuestos en función de su potencial para provocar neurotoxicidad del desarrollo está en alta demanda14. El aumento de la prevalencia y la incidencia de trastornos neurológicos junto con la abundancia de compuestos no probados en el medio ambiente requiere el desarrollo de experimentos más fiables y eficientes para identificar compuestos ambientales peligrosos que puedan suponer neurotoxicidad15.
El método presentado aquí se puede utilizar para detectar la capacidad de los compuestos para inducir el crecimiento de la neurita y la neurotoxicidad aprovechando las neuronas derivadas de células progenitoras neuronales humanas, un modelo celular que representa estrechamente la biología humana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo es uno de los pocos artículos publicados que describen la prueba de la longitud de la neurita tras el tratamiento con compuestos de prueba. Además, describimos cómo utilizar hNPCs para un ensayo de crecimiento de neurita y una evaluación de neurotoxicidad. Mediante la utilización de este ensayo de crecimiento de neurita y la evaluación de la neurotoxicidad en las neuronas derivadas de hNPCs, se demuestra el potencial neurogénico de una categoría de compuestos epigenéticos de moléculas pequeñas, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada por la beca de investigación NIMAD (940714) otorgada a MAF.
Materials
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 – minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1℃/minute cell freezing in a -80℃ freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly‐L‐lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
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