Neurite Outgrowth שיטת והערכה רעילות נוירועם האדם העצבי תא מחולל נוירונים
Summary
הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה לneurite מוצלח הערכה ורעילות המוח של תרכובות מולקולה קטנה.
Abstract
Neurite מוצלח הערכה ורעילות נוירולוגיה הם שני מחקרים עיקריים שניתן לבצע באמצעות השיטה המוצגת להלן. פרוטוקול זה מספק ניתוח אמין של מורפולוגיה עצבית יחד עם מדידות כמותיים של שינויים על אורך neurite ולוקליזציה חלבון סינפטית ושפע על הטיפול עם תרכובות מולקולה קטנה. בנוסף ליישום של השיטה המוצגת במחקרים neurite מוצלח, הערכה רעילות נוירו ניתן לבצע כדי להעריך, להבחין ולדרג תרכובות כימיות מסחריות מבוסס על ההשפעה הפוטנציאלית שלהם התפתחותית התפתחותיות.
למרות קווי התא הם כיום בשימוש נרחב ההקרנה מורכבים בחני מדעי המוח, הם לעתים קרובות שונים גנטית ופנופנטיות בדרך כלל ממקור הרקמה שלהם. תאים ראשוניים, מצד שני, לשמור על סמנים חשובים פונקציות נצפתה ב vivo. לכן, בשל פוטנציאל התרגום והרלוונטיות הפיזיולוגית שתאים אלה יכולים להציע שיטת neurite מוצלח והערכה של רעילות עצבית יכולה להועיל במידה ניכרת משימוש בתאים של מחולל קדמון אנושי (hnpcs) כמודל התא הראשי של האדם.
השיטה המוצגת במסמך זה יכול להיות מנוצל על המסך עבור היכולת של תרכובות כדי לגרום neurite מוצלח ו רעילות נוירורעלים על ידי ניצול של הנוירונים האדם הגוף האנושי הנגזר, מודל התא המייצג היטב את הביולוגיה האנושית.
Introduction
Neurite צמיחה היא תהליך בסיסי להיווצרות הרשת העצבית והתחדשות העצב1,2. בעקבות פציעה, neurite מוצלח ממלאת תפקיד מרכזי בהתחדשות של מערכת העצבים. Neurite מוצלח הוא גם מרכיב חשוב של איתות החילוץ בגרימת פעילויות רגנרטיבית נוירואליות כדי לשפר את התוצאות עבור הפרעות ניווניות ופציעה עצבית3,4,5,6.
על-ידי שמירה על פוטנציאל הבידול שלהם בהפקת לשונות עצבית שונים, תאי האדם העצביים האנושיים (hnpcs) יכולים לספק מערכת מודל למחקרים של פונקציית מערכת העצבים המרכזית (cn) ופיתוח7,8,9. פוטנציאל translational גבוהה ורלוונטיות פיזיולוגית של hNPCs כמודל הראשי של התא האנושי להציע יתרון ניכר neurite outgrowth הקשורות לגילוי סמים הקרנות. עם זאת, התחזוקה ושינוי קנה המידה של דגמי התאים הראשיים לקבלת תפוקה גבוהה יכול לגזול זמן רב ועבודה מוגברת של10,11,12,13.
בנוסף ליישום של השיטה המוצגת במחקרים neurite מוצלח, הערכה רעילות נוירו היא יישום אחר באמצעות נוירונים hnpc נגזר. יש אלפי תרכובות כימיות מסחריות שאינן נבדקות או בעלי פוטנציאל מובן מאליו של רעילות עצבית. לכן, ניסויים יותר אמין ואפקטיבי ההקרנה כדי להעריך, להבחין, ודירוג התרכובות בהתבסס על הפוטנציאל שלהם לעורר רעילות נוירוהתפתחותית היא ביקוש גבוה14. הגידול בשכיחות ושכיחות של הפרעות נוירולוגיות יחד עם שפע של תרכובות נבדק בסביבה מחייבת פיתוח של ניסויים אמין יותר ויעיל כדי לזהות תרכובות סביבתיות מסוכנים שעלולים להוות רעילות נוירורעילה15.
השיטה המוצגת במסמך זה יכול להיות מנוצל על המסך עבור היכולת של תרכובות כדי לגרום neurite מוצלח ו רעילות עצביים על ידי ניצול של הנוירונים האדם הגוף האנושי הנגזר, מודל התא המייצג היטב את הביולוגיה האנושית.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה הוא אחד העיתונים המעטים שפורסמו המתארת את הבדיקה לאורך neurite על הטיפול עם תרכובות הבדיקה. יתר על כן, אנו מתארים כיצד להשתמש hnpcs עבור שיטת neurite מוצלח והערכה רעילות נוירו. על ידי ניצול זה הneurite מוצלח הערכה ורעילות המוח על הנוירונים הנגזרים מסוג hnpcs, הפוטנציאל הנוירוגני של קטגוריה של …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי מענק מחקר NIMAD (940714) הוענק MAF.
Materials
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 – minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1℃/minute cell freezing in a -80℃ freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly‐L‐lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
References
- Sherman, S. P., Bang, A. G. High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
- Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. In vitro models of axon regeneration. Experimental Neurology. 287, 423-434 (2017).
- Kudo, T., et al. Induction of neurite outgrowth in PC12 cells treated with temperature-controlled repeated thermal stimulation. PloS One. 10 (4), 0124024 (2015).
- Higgins, S., Lee, J. S., Ha, L., Lim, J. Y. Inducing neurite outgrowth by mechanical cell stretch. BioResearch Open Access. 2 (3), 212-216 (2013).
- Muramatsu, R., Ueno, M., Yamashita, T. Intrinsic regenerative mechanisms of central nervous system neurons. Bioscience Trends. 3 (5), (2009).
- Read, D. E., Herbert, K. R., Gorman, A. M. Heat shock enhances NGF-induced neurite elongation which is not mediated by Hsp25 in PC12 cells. Brain Research. 1221, 14-23 (2008).
- Finan, G. M., et al. Bioactive Compound Screen for Pharmacological Enhancers of Apolipoprotein E in Primary Human Astrocytes. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1526-1538 (2016).
- Magistri, M., et al. A comparative transcriptomic analysis of astrocytes differentiation from human neural progenitor cells. European Journal of Neuroscience. 44 (10), 2858-2870 (2016).
- Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Research. 993 (1-2), 18-29 (2003).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. The Lancet Neurology. 13 (3), 330-338 (2014).
- Finkbeiner, S., Frumkin, M., Kassner, P. D. Cell-based screening: extracting meaning from complex data. Neuron. 86 (1), 160-174 (2015).
- An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Molecular Biotechnology. 45 (2), 180-186 (2010).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507 (2011).
- Ryan, K. R., et al. Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity. Neurotoxicology. 53, 271-281 (2016).
- Magistri, M., Velmeshev, D., Makhmutova, M., Faghihi, M. A. Transcriptomics profiling of Alzheimer’s disease reveal neurovascular defects, altered amyloid-β homeostasis, and deregulated expression of long noncoding RNAs. Journal of Alzheimer’s Disease. 48 (3), 647-665 (2015).
- Darbinyan, A., Kaminski, R., White, M. K., Darbinian, N., Khalili, K. Isolation and propagation of primary human and rodent embryonic neural progenitor cells and cortical neurons. Neuronal Cell Culture. , 45-54 (2013).
- Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay. The Anatomical Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
- Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 6 (1), 2 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43 (1), 25-30 (2007).
- Bagheri, A., et al. HDAC Inhibitors Induce BDNF Expression and Promote Neurite Outgrowth in Human Neural Progenitor Cells-Derived Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1109 (2019).
- Sartor, G. C., et al. Enhancement of BDNF expression and memory by HDAC inhibition requires BET bromodomain reader proteins. Journal of Neuroscience. 39 (4), 612-626 (2019).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319 (2009).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Developmental neurotoxicity of industrial chemicals. The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).
- Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature reviews Drug Discovery. 7 (8), 659 (2008).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).
- Yeo, Y., et al. Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden. BioMed Research International. 2019, (2019).
