Ein Neurit Engrowth Assay und Neurotoxizität Satonie-Bewertung mit menschlichen neuronalen Vorläufer Cell-Derived Neuronen
Summary
Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine Methode für einen Neuriten-Auswuchs-Assay und neurotoxizitätsbewertete kleine Molekülverbindungen.
Abstract
Neuriten-Auswuchs-Assay und Neurotoxizitätsbewertung sind zwei wichtige Studien, die mit der vorgestellten Methode hierin durchgeführt werden können. Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige Analyse der neuronalen Morphologie zusammen mit quantitativen Messungen von Modifikationen auf Neuritenlänge und synaptische Proteinlokalisierung und Fülle bei der Behandlung mit kleinen Molekülverbindungen. Zusätzlich zur Anwendung der vorgestellten Methode in Neuriten-Auswuchsstudien kann eine Neurotoxizitätsbewertung durchgeführt werden, um kommerzielle chemische Verbindungen auf der Grundlage ihrer potenziellen Entwicklungs-Neurotoxizitätswirkung zu bewerten, zu unterscheiden und zu ordnen.
Obwohl Zelllinien heutzutage in zusammengesetzten Screening-Assays in der Neurowissenschaft weit verbreitet sind, unterscheiden sie sich oft genetisch und phänotypisch von ihrem Gewebeursprung. Primärzellen hingegen behalten wichtige Marker und Funktionen bei, die in vivo beobachtet werden. Aufgrund des Übersetzungspotenzials und der physiologischen Relevanz, dass diese Zellen einen Neuriten-Auswuchs-Assay anbieten könnten, kann die Neurotoxizitätsbewertung erheblich von der Verwendung menschlicher neuronaler Vorläuferzellen (hNPCs) als primäres menschliches Zellmodell profitieren.
Die vorgestellte Methode hierin kann verwendet werden, um für die Fähigkeit von Verbindungen zu untersuchen, um Neuritenwachstum und Neurotoxizität zu induzieren, indem die Vorteile der menschlichen neuronalen Vorläuferzell-abgeleiteten Neuronen, ein Zellmodell, das eng die menschliche Biologie darstellt.”
Introduction
Das Neuritwachstum ist ein Prozess, der für die Bildung des neuronalen Netzwerks und der Nervenregeneration1,2von grundlegender Bedeutung ist. Nach einer Verletzung spielt das Neuritenwachstum eine Schlüsselrolle bei der Regeneration des Nervensystems. Neuritenwachstum ist auch ein wichtiges Element der extrazellulären Signalisierung bei der Induktion neuronaler regenerativer Aktivitäten zur Verbesserung der Ergebnisse bei neurodegenerativen Erkrankungen und neuronalen Verletzungen3,4,5,6.
Durch die Aufrechterhaltung ihres Differenzierungspotenzials bei der Herstellung verschiedener neuronaler Abstammungen könnten menschliche neuronale Vorläuferzellen (hNPCs) ein Modellsystem für Studien der Funktion des zentralnervensystems (ZNS) und der Entwicklung7,8,9. Hohes Translationspotenzial und physiologische Relevanz von hNPCs als primäres menschliches Zellmodell bieten einen erheblichen Vorteil bei neurititbedingten Antik-Entdeckungsscreenings. Die Wartung und Skalierung der primären Zellmodelle für Tests mit hohem Durchsatz kann jedoch zeitaufwändig und arbeitsintensiv sein10,11,12,13.
Neben der Anwendung der vorgestellten Methode in Neuriten-Auswuchsstudien ist die Neurotoxizitätsbewertung eine weitere Anwendung mit den hNPC-abgeleiteten Neuronen. Es gibt Tausende von kommerziellen chemischen Verbindungen, die entweder nicht untersucht werden oder mit schlecht verstandenem Neurotoxizitätspotenzial. Daher sind zuverlässigere und effektivere Screening-Experimente zur Bewertung, Unterscheidung und Rangfolge von Verbindungen basierend auf ihrem Potenzial, eine Entwicklungsneurotoxizität auszulösen, sehr gefragt14. Die Zunahme der Prävalenz und Inzidenz von neurologischen Störungen zusammen mit der Fülle von ungetesteten Verbindungen in der Umwelt erfordert die Entwicklung von vertrauenswürdigeren und effizienteren Experimenten, um gefährliche Umweltverbindungen zu identifizieren, die Neurotoxizität darstellen können15.
Die vorgestellte Methode hierin kann verwendet werden, um für die Fähigkeit von Verbindungen zu untersuchen, um Neuritenwachstum und Neurotoxizität zu induzieren, indem die Vorteile der menschlichen neuronalen Vorläufer-Zell-abgeleiteten Neuronen, ein Zellmodell, das eng die menschliche Biologie darstellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll ist eines der wenigen veröffentlichten Papiere, die den Test auf Neuritenlänge bei der Behandlung mit Testverbindungen beschreiben. Darüber hinaus beschreiben wir, wie hNPCs für einen Neuriten-Outgrowth-Assay und eine Neurotoxizitätsbewertung verwendet werden. Durch die Verwendung dieses Neuriten-Outgrowth-Assays und der Neurotoxizitätsbewertung an hNPCs-abgeleiteten Neuronen wird das neurogene Potenzial einer Kategorie von epigenetischen Kleinmolekülverbindungen, HDAC-Hemmern, bei der Induktion v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch ein NIMAD-Forschungsstipendium (940714) finanziert, das mAF gewährt wurde.
Materials
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 – minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1℃/minute cell freezing in a -80℃ freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly‐L‐lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
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