Нейрит Анализ нарост и нейротоксичность оценка с нейронным предшественником человека клетки-производные нейронов
Summary
Представленный протокол описывает метод нейритового анализа наростов и оценки нейротоксичности малых молекулярных соединений.
Abstract
Neurite анализ нарост и нейротоксичность оценки двух основных исследований, которые могут быть выполнены с использованием представленного метода здесь. Данный протокол обеспечивает надежный анализ нейрональной морфологии вместе с количественными измерениями модификаций по длине нейрита и локализации синаптического белка и изобилию при лечении небольшими молекулярными соединениями. В дополнение к применению представленного метода в исследованиях нейритового роста, оценка нейротоксичности может быть выполнена для оценки, разграничения и ранжирования коммерческих химических соединений на основе их потенциального эффекта нейротоксичности развития.
Хотя клеточные линии в настоящее время широко используются в сложных анализов скрининга в неврологии, они часто отличаются генетически и фенотипически от их происхождения тканей. Первичные клетки, с другой стороны, поддерживают важные маркеры и функции, наблюдаемые in vivo. Таким образом, из-за потенциала перевода и физиологической значимости, что эти клетки могут предложить нейрит анализ роста и нейротоксичность оценка может значительно извлечь выгоду из использования человеческих нейронных клеток-предшественников (HNPCs) в качестве основной модели клеток человека.
Представленный метод здесь может быть использован для проверки на способность соединений, чтобы вызвать нейритовой нарост и нейротоксичность, воспользовавшись человеческого нервного прародителя клеточных нейронов, клеточной модели тесно представляющих человеческой биологии “.
Introduction
Neurite роста является процессом, основополагающим для формирования нейронной сети и регенерации нервов1,2. После травмы, нейрит нарост играет ключевую роль в регенерации нервной системы. Нейрит нарост также является важным элементом внеклеточной сигнализации в индуцировании нейронных регенеративных мероприятий для повышения результатов для нейродегенеративных расстройств и нейрональных травм3,4,5,6.
Поддерживая свой потенциал дифференциации в производстве различных нейронных линий, клетки-предшественники человека (HNPCs) могли бы обеспечить модельную систему для изучения функции центральной нервной системы (ЦНС) и развития7,,8,9. Высокий переводческий потенциал и физиологическая значимость ГНПЦ в качестве основной модели клеток человека дают значительное преимущество в скринингах обнаружения лекарств, связанных с нейритом. Тем не менее, обслуживание и масштабирование основных моделей клеток для анализа высокой пропускной способности может быть трудоемким и трудоемким10,,11,,12,13.
В дополнение к применению представленного метода в исследованиях нейритового нарастания, оценка нейротоксичности является еще одним приложением с использованием нейронов, полученных из hNPC. Существуют тысячи коммерческих химических соединений, которые либо не рассматриваются или с плохо понимаемой нейротоксичности потенциал. Таким образом, более надежные и эффективные скрининговые эксперименты для оценки, разграничения и ранжирования соединений на основе их потенциала для получения развития нейротоксичности пользуется большим спросом14. Увеличение распространенности и частоты неврологических расстройств наряду с обилием непроверенных соединений в окружающей среде требует разработки более надежных и эффективных экспериментов по выявлению опасных экологических соединений, которые могут представлять нейротоксичность15.
Представленный метод здесь может быть использован для проверки на способность соединений, чтобы вызвать нейритовой нарост и нейротоксичность, воспользовавшись человеческим нейроном нервного прародителя, полученных из клетки, клеточной модели, тесно представляющей человеческую биологию.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол является одним из немногих опубликованных работ, описывающих тест на нейрит длины при лечении с тестовыми соединениями. Кроме того, мы описываем, как использовать hNPCs для нейритового анализа нароста и оценки нейротоксичности. Используя этот анализ нейритового роста и оце…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было профинансировано грантовом исследования NIMAD (940714), присужденным MAF.
Materials
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 – minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1℃/minute cell freezing in a -80℃ freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly‐L‐lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
References
- Sherman, S. P., Bang, A. G. High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
- Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. In vitro models of axon regeneration. Experimental Neurology. 287, 423-434 (2017).
- Kudo, T., et al. Induction of neurite outgrowth in PC12 cells treated with temperature-controlled repeated thermal stimulation. PloS One. 10 (4), 0124024 (2015).
- Higgins, S., Lee, J. S., Ha, L., Lim, J. Y. Inducing neurite outgrowth by mechanical cell stretch. BioResearch Open Access. 2 (3), 212-216 (2013).
- Muramatsu, R., Ueno, M., Yamashita, T. Intrinsic regenerative mechanisms of central nervous system neurons. Bioscience Trends. 3 (5), (2009).
- Read, D. E., Herbert, K. R., Gorman, A. M. Heat shock enhances NGF-induced neurite elongation which is not mediated by Hsp25 in PC12 cells. Brain Research. 1221, 14-23 (2008).
- Finan, G. M., et al. Bioactive Compound Screen for Pharmacological Enhancers of Apolipoprotein E in Primary Human Astrocytes. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1526-1538 (2016).
- Magistri, M., et al. A comparative transcriptomic analysis of astrocytes differentiation from human neural progenitor cells. European Journal of Neuroscience. 44 (10), 2858-2870 (2016).
- Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Research. 993 (1-2), 18-29 (2003).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. The Lancet Neurology. 13 (3), 330-338 (2014).
- Finkbeiner, S., Frumkin, M., Kassner, P. D. Cell-based screening: extracting meaning from complex data. Neuron. 86 (1), 160-174 (2015).
- An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Molecular Biotechnology. 45 (2), 180-186 (2010).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507 (2011).
- Ryan, K. R., et al. Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity. Neurotoxicology. 53, 271-281 (2016).
- Magistri, M., Velmeshev, D., Makhmutova, M., Faghihi, M. A. Transcriptomics profiling of Alzheimer’s disease reveal neurovascular defects, altered amyloid-β homeostasis, and deregulated expression of long noncoding RNAs. Journal of Alzheimer’s Disease. 48 (3), 647-665 (2015).
- Darbinyan, A., Kaminski, R., White, M. K., Darbinian, N., Khalili, K. Isolation and propagation of primary human and rodent embryonic neural progenitor cells and cortical neurons. Neuronal Cell Culture. , 45-54 (2013).
- Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay. The Anatomical Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
- Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 6 (1), 2 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43 (1), 25-30 (2007).
- Bagheri, A., et al. HDAC Inhibitors Induce BDNF Expression and Promote Neurite Outgrowth in Human Neural Progenitor Cells-Derived Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1109 (2019).
- Sartor, G. C., et al. Enhancement of BDNF expression and memory by HDAC inhibition requires BET bromodomain reader proteins. Journal of Neuroscience. 39 (4), 612-626 (2019).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319 (2009).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Developmental neurotoxicity of industrial chemicals. The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).
- Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature reviews Drug Discovery. 7 (8), 659 (2008).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).
- Yeo, Y., et al. Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden. BioMed Research International. 2019, (2019).
