Een Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment met Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons
Summary
Het gepresenteerde protocol beschrijft een methode voor een neuriet ontgroeiingstest en neurotoxiciteitsbeoordeling van kleine moleculen.
Abstract
Neurite uitgroei test en neurotoxiciteit beoordeling zijn twee belangrijke studies die kunnen worden uitgevoerd met behulp van de gepresenteerde methode hierin. Dit protocol biedt betrouwbare analyse van neuronale morfologie samen met kwantitatieve metingen van wijzigingen op neurietlengte en synaptische eiwitlokalisatie en overvloed bij behandeling met kleine moleculeverbindingen. Naast de toepassing van de gepresenteerde methode in neurite uitgroei studies, neurotoxiciteit beoordeling kan worden uitgevoerd om te beoordelen, onderscheiden en rangschikken commerciële chemische verbindingen op basis van hun potentiële ontwikkelingsneurotoxiciteit effect.
Hoewel cellijnen tegenwoordig op grote schaal worden gebruikt in samengestelde screeningtesten in de neurowetenschappen, verschillen ze vaak genetisch en fenotypisch van hun weefseloorsprong. Primaire cellen, aan de andere kant, behouden belangrijke markers en functies waargenomen in vivo. Daarom, als gevolg van de vertaling potentieel en fysiologische relevantie die deze cellen kunnen bieden neurite uitgroei test en neurotoxiciteit beoordeling kan aanzienlijk profiteren van het gebruik van menselijke neurale voorloper cellen (hNPC’s) als de primaire menselijke cel model.
De gepresenteerde methode hierin kan worden gebruikt om te screenen op het vermogen van verbindingen om neuriet ontgroeiing en neurotoxiciteit te induceren door gebruik te maken van de menselijke neurale voorloper cel-afgeleide neuronen, een cel model nauw vertegenwoordigen menselijke biologie.”
Introduction
Neurite groei is een proces fundamenteel voor de vorming van het neuronale netwerk en zenuwregeneratie1,2. Na een blessure speelt neurite ontgroeiing een belangrijke rol in de regeneratie van het zenuwstelsel. Neurite uitgroei is ook een belangrijk element van de extracellulaire signalering in het induceren van neuronale regeneratieve activiteiten om de resultaten voor neurodegeneratieve aandoeningen en neuronale letsel3,4,5,6te verbeteren .
Door het handhaven van hun differentiatie potentieel in de productie van verschillende neurale afstammingen, menselijke neurale voorloper cellen (hNPC’s) kan een modelsysteem voor studies van het centrale zenuwstelsel (CNS) functie en ontwikkeling7,8,9. Een hoog translationeel potentieel en fysiologische relevantie van hNPC’s als primair menselijk celmodel bieden een aanzienlijk voordeel bij neurite ontgroeigerelateerde drug discovery screenings. Het onderhoud en de schaling van de primaire celmodellen voor hoogdoorvoertesten kan echter tijdrovend en arbeidsintensief zijn10,11,12,13.
Naast de toepassing van de gepresenteerde methode in neurite uitgroei studies, neurotoxiciteit beoordeling is een andere toepassing met behulp van de hNPC-afgeleide neuronen. Er zijn duizenden commerciële chemische verbindingen die ofwel niet worden onderzocht of met slecht begrepen neurotoxiciteit potentieel. Daarom is er meer betrouwbare en effectieve screeningsexperimenten om verbindingen te beoordelen, te onderscheiden en te rangschikken op basis van hun potentieel om ontwikkelingsneurotoxiciteit uit te lokken in hoge vraag14. De toename van prevalentie en incidentie van neurologische aandoeningen, samen met de overvloed aan niet-geteste verbindingen in het milieu vereist de ontwikkeling van meer betrouwbare en efficiënte experimenten om gevaarlijke milieuverbindingen te identificeren die neurotoxiciteit kunnen opleveren15.
De gepresenteerde methode hierin kan worden gebruikt om te screenen op het vermogen van verbindingen om neuriet ontgroeiing en neurotoxiciteit te induceren door gebruik te maken van de menselijke neurale voorloper cel-afgeleide neuronen, een cel model nauw vertegenwoordigen menselijke biologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol is een van de weinige gepubliceerde papers beschrijven van de test voor neurite lengte bij behandeling met testverbindingen. Verder beschrijven we hoe hNPC’s te gebruiken voor een neurite uitgroeitest en neurotoxiciteitsbeoordeling. Door gebruik te maken van deze neuriet ontgroeiingstest en neurotoxiciteitsbeoordeling op door hNPC’s afgeleide neuronen, wordt het neurogene potentieel van een categorie epigenetische kleinemoleculaire verbindingen, HDAC-remmers, inducerende neurotische uitgroei aangetoond<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door NIMAD onderzoeksbeurs (940714) toegekend aan MAF.
Materials
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 – minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1℃/minute cell freezing in a -80℃ freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly‐L‐lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
References
- Sherman, S. P., Bang, A. G. High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
- Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. In vitro models of axon regeneration. Experimental Neurology. 287, 423-434 (2017).
- Kudo, T., et al. Induction of neurite outgrowth in PC12 cells treated with temperature-controlled repeated thermal stimulation. PloS One. 10 (4), 0124024 (2015).
- Higgins, S., Lee, J. S., Ha, L., Lim, J. Y. Inducing neurite outgrowth by mechanical cell stretch. BioResearch Open Access. 2 (3), 212-216 (2013).
- Muramatsu, R., Ueno, M., Yamashita, T. Intrinsic regenerative mechanisms of central nervous system neurons. Bioscience Trends. 3 (5), (2009).
- Read, D. E., Herbert, K. R., Gorman, A. M. Heat shock enhances NGF-induced neurite elongation which is not mediated by Hsp25 in PC12 cells. Brain Research. 1221, 14-23 (2008).
- Finan, G. M., et al. Bioactive Compound Screen for Pharmacological Enhancers of Apolipoprotein E in Primary Human Astrocytes. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1526-1538 (2016).
- Magistri, M., et al. A comparative transcriptomic analysis of astrocytes differentiation from human neural progenitor cells. European Journal of Neuroscience. 44 (10), 2858-2870 (2016).
- Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Research. 993 (1-2), 18-29 (2003).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. The Lancet Neurology. 13 (3), 330-338 (2014).
- Finkbeiner, S., Frumkin, M., Kassner, P. D. Cell-based screening: extracting meaning from complex data. Neuron. 86 (1), 160-174 (2015).
- An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Molecular Biotechnology. 45 (2), 180-186 (2010).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507 (2011).
- Ryan, K. R., et al. Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity. Neurotoxicology. 53, 271-281 (2016).
- Magistri, M., Velmeshev, D., Makhmutova, M., Faghihi, M. A. Transcriptomics profiling of Alzheimer’s disease reveal neurovascular defects, altered amyloid-β homeostasis, and deregulated expression of long noncoding RNAs. Journal of Alzheimer’s Disease. 48 (3), 647-665 (2015).
- Darbinyan, A., Kaminski, R., White, M. K., Darbinian, N., Khalili, K. Isolation and propagation of primary human and rodent embryonic neural progenitor cells and cortical neurons. Neuronal Cell Culture. , 45-54 (2013).
- Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay. The Anatomical Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
- Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 6 (1), 2 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43 (1), 25-30 (2007).
- Bagheri, A., et al. HDAC Inhibitors Induce BDNF Expression and Promote Neurite Outgrowth in Human Neural Progenitor Cells-Derived Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1109 (2019).
- Sartor, G. C., et al. Enhancement of BDNF expression and memory by HDAC inhibition requires BET bromodomain reader proteins. Journal of Neuroscience. 39 (4), 612-626 (2019).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319 (2009).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Developmental neurotoxicity of industrial chemicals. The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).
- Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature reviews Drug Discovery. 7 (8), 659 (2008).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).
- Yeo, Y., et al. Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden. BioMed Research International. 2019, (2019).
