Uso de embriones congelados descongelados para la producción de alta eficiencia de ratones modificados genéticamente
Summary
Aquí, presentamos un método modificado para la criopreservación de embriones unicelulares, así como un protocolo que combina el uso de embriones de congelación descongelado y electroporación para la generación eficiente de ratones modificados genéticamente.
Abstract
El uso de ratones modificados genéticamente (GM) se ha vuelto crucial para comprender la función génica y descifrar los mecanismos subyacentes de las enfermedades humanas. El sistema CRISPR/Cas9 permite a los investigadores modificar el genoma con una eficiencia, fidelidad y simplicidad sin precedentes. Aprovechando esta tecnología, los investigadores buscan un protocolo rápido, eficiente y fácil para generar ratones modificados genéticamente. Aquí introducimos un método mejorado para la criopreservación de embriones unicelulares que conduce a una mayor tasa de desarrollo de los embriones liofilconantes. Al combinarlo con condiciones de electroporación optimizadas, este protocolo permite la generación de ratones knockout y knock-in con alta eficiencia y bajas tasas de mosaico en poco tiempo. Además, mostramos una explicación paso a paso de nuestro protocolo optimizado, que cubre la preparación de reactivos CRISPR, la fertilización in vitro, la criopreservación y descongelación de embriones de una célula, la electroporación de reactivos CRISPR, la generación de ratones y el genotipado de los fundadores. Con este protocolo, los investigadores deben ser capaces de preparar ratones modificados genéticamente con una facilidad, velocidad y eficiencia sin igual.
Introduction
El sistema de repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) agrupados regularmente es un avance científico que proporciona una modificación específica sin precedentes en el genoma1. El sistema CRISPR/Cas9 está compuesto por proteínaCas Cas9 y ARN guía (gRNA) con dos componentes moleculares: un ARN CRISPR (CRRNA) específico de destino y un ARN CRISPR transactivador (tracrRNA)2 . Un gRNA dirige la proteína Cas9 al locus específico en el genoma, 20 nucleótidos complementarios al crRNA, y adyacentes al motivo adyacente protoespacial (PAM). La proteína Cas9 se une a la secuencia diana e induce roturas de doble cadena (DSB) que se reparan mediante unión final no homóloga no homóloga propensa a errores (NHEJ) o por reparación dirigida por homología de alta fidelidad (HDR)3,,4,5. El NHEJ conduce a inserciones o/y deleciones (indels), y por lo tanto a la pérdida de función genética cuando se dirige una secuencia de codificación. El HDR conduce a una edición precisa del genoma en presencia de una plantilla de reparación que contiene secuencias de homología3,4,5. El NHEJ y el HDR han sido aprovechados para generar ratones knockout y knock-in, respectivamente.
Si bien el sistema CRISPR/Cas9 ha acelerado notablemente la generación de ratones modificados genéticamente con una eficacia y fidelidad excepcionales, los científicos que aplican estos métodos a menudo se encuentran con desafíos técnicos. En primer lugar, los protocolos convencionales requieren microinyección para introducir las herramientas de edición CRISPR en el pronúcleo de los óvulos fertilizados6,7. Esta técnica consume mucho tiempo y por lo general requiere una amplia formación. Así, varios grupos sustituyeron la microinyección por electroporación8,,9,,10,,11,12,13. Sin embargo, en los primeros protocolos de electroporación se utilizaron embriones frescos para la electroporación. Esto causó otro problema, porque preparar embriones frescos antes de cada experimento es difícil14.
Recientemente nosotros y otros hemos combinado el uso de embriones de congelación y electroporación para la edición del genoma, lo que facilita la generación de ratones modificados genéticamente15,,16. Este protocolo permite a los investigadores sin habilidades avanzadas de manipulación de embriones generar rápidamente modelos animales de enfermedades humanas con alta eficiencia. El protocolo también reduce significativamente los desafíos prácticos en la generación de ratones modificados genéticamente, como la heterogeneidad genética en los fundadores16. Para superar el mosaico, realizamos la electroporación de reactivos CRISPR dentro de 1 h después de la descongelación del embrión para asegurar que la edición se produce antes de la primera replicación del genoma. Otra mejora incluye el uso de proteína Cas9 en lugar de ARNm Cas9 para reducir el mosaico indeseable17. Además, desarrollamos un método óptimo para la criopreservación de embriones de una célula que aumenta la tasa de desarrollo a la etapa de dos células16:el uso de suero bovino fetal (FBS) mejora dramáticamente la supervivencia de los ovocitos liofilizados después de la fertilización, tal vez por el mismo mecanismo que hace que los ovocitos no fecundos liofilizados sean más resistentes18.
Aquí presentamos un protocolo integral para la generación de ratones modificados genéticamente utilizando embriones liofilizados, incluyendo el método modificado para la criopreservación de embriones C57BL/6J de una célula. Incluye 1) diseño de gRNA, preparación y montaje de reactivos CRISPR; 2) FIV, criopreservación y descongelación de embriones unicelulares; 3) Electroporación de reactivos CRISPR en embriones liofilconantes descongelados; 4) Transferencia de embriones al oviducto de ratones hembra pseudoembarazada; y 5) Genotipado y análisis de secuencia de los animales fundadores de F0.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito permite la generación de ratones modificados genéticamente con alta eficiencia y bajas tasas de mosaico(Tabla 1). Permite a los investigadores sin habilidades avanzadas de manipulación de embriones crear ratones mutantes fácilmente porque aprovecha los últimos y más útiles avances en ingeniería reproductiva y tecnologías de edición del genoma: ribonucleoprotein (RNP) CRISPR/Cas9 y electroporación en embriones de congelación descongelación. Estos avances facilitaron y ag…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos agradecer a Hitomi Sawada y Elizabeth García por el cuidado de los animales. Este trabajo fue apoyado por KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 y 16K01946) y Hokugin Research Grant (a H.N.), y Jichi Medical University Young Investigator Award (a H.U.). La Fundación de Becas Otsuka Toshimi apoyó a M.D.
Materials
| 0.25 M Sucrose | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | SUCROSE | |
| 1 M DMSO | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | 1M DMSO | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | Vetorphale 5mg | |
| Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1081060 | |
| C57BL/6J mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| DAP213 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | DAP213 | |
| FBS | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | ES-009-C | |
| hCG | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan) | HCG Mochida 3000 | |
| HTF | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | HTF | |
| ICR mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| Isoflurane | Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO) | 07-893-1389 | |
| KSOM | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | KSOM | |
| LN2 Tank | Chart Industries (Ball Ground, GA) | XC 34/18 | |
| M2 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | M2 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan) | 1124401A1060 | |
| Microscope | Nikon Co. (Tokyo, Japan) | SMZ745T | |
| Midazolam | Sandoz K.K. (Tokyo, Japan) | 1124401A1060 | |
| Nuclease free buffer | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1072570 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | Takara Bio Inc (Kusatsu, Japan) | 740952 .5 | |
| One-hole slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan) | S339929 | |
| One-step type Electroporator | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | CUY21EDIT II | |
| Paraffin Liquid | NACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan) | SP 26137-85 | |
| Platinum plate electrode | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | LF501PT1-10, GE-101 | |
| PMSG | ASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan) | SEROTROPIN 1000 | |
| Povidone iodide | Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY) | C12400 | |
| Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM I | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | 22600134 | |
| Two-step type Electroporator | Nepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan) | NEPA21 |
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