Summary

Uso de embriones congelados descongelados para la producción de alta eficiencia de ratones modificados genéticamente

Published: April 02, 2020
doi:

Summary

Aquí, presentamos un método modificado para la criopreservación de embriones unicelulares, así como un protocolo que combina el uso de embriones de congelación descongelado y electroporación para la generación eficiente de ratones modificados genéticamente.

Abstract

El uso de ratones modificados genéticamente (GM) se ha vuelto crucial para comprender la función génica y descifrar los mecanismos subyacentes de las enfermedades humanas. El sistema CRISPR/Cas9 permite a los investigadores modificar el genoma con una eficiencia, fidelidad y simplicidad sin precedentes. Aprovechando esta tecnología, los investigadores buscan un protocolo rápido, eficiente y fácil para generar ratones modificados genéticamente. Aquí introducimos un método mejorado para la criopreservación de embriones unicelulares que conduce a una mayor tasa de desarrollo de los embriones liofilconantes. Al combinarlo con condiciones de electroporación optimizadas, este protocolo permite la generación de ratones knockout y knock-in con alta eficiencia y bajas tasas de mosaico en poco tiempo. Además, mostramos una explicación paso a paso de nuestro protocolo optimizado, que cubre la preparación de reactivos CRISPR, la fertilización in vitro, la criopreservación y descongelación de embriones de una célula, la electroporación de reactivos CRISPR, la generación de ratones y el genotipado de los fundadores. Con este protocolo, los investigadores deben ser capaces de preparar ratones modificados genéticamente con una facilidad, velocidad y eficiencia sin igual.

Introduction

El sistema de repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) agrupados regularmente es un avance científico que proporciona una modificación específica sin precedentes en el genoma1. El sistema CRISPR/Cas9 está compuesto por proteínaCas Cas9 y ARN guía (gRNA) con dos componentes moleculares: un ARN CRISPR (CRRNA) específico de destino y un ARN CRISPR transactivador (tracrRNA)2 . Un gRNA dirige la proteína Cas9 al locus específico en el genoma, 20 nucleótidos complementarios al crRNA, y adyacentes al motivo adyacente protoespacial (PAM). La proteína Cas9 se une a la secuencia diana e induce roturas de doble cadena (DSB) que se reparan mediante unión final no homóloga no homóloga propensa a errores (NHEJ) o por reparación dirigida por homología de alta fidelidad (HDR)3,,4,5. El NHEJ conduce a inserciones o/y deleciones (indels), y por lo tanto a la pérdida de función genética cuando se dirige una secuencia de codificación. El HDR conduce a una edición precisa del genoma en presencia de una plantilla de reparación que contiene secuencias de homología3,4,5. El NHEJ y el HDR han sido aprovechados para generar ratones knockout y knock-in, respectivamente.

Si bien el sistema CRISPR/Cas9 ha acelerado notablemente la generación de ratones modificados genéticamente con una eficacia y fidelidad excepcionales, los científicos que aplican estos métodos a menudo se encuentran con desafíos técnicos. En primer lugar, los protocolos convencionales requieren microinyección para introducir las herramientas de edición CRISPR en el pronúcleo de los óvulos fertilizados6,7. Esta técnica consume mucho tiempo y por lo general requiere una amplia formación. Así, varios grupos sustituyeron la microinyección por electroporación8,,9,,10,,11,12,13. Sin embargo, en los primeros protocolos de electroporación se utilizaron embriones frescos para la electroporación. Esto causó otro problema, porque preparar embriones frescos antes de cada experimento es difícil14.

Recientemente nosotros y otros hemos combinado el uso de embriones de congelación y electroporación para la edición del genoma, lo que facilita la generación de ratones modificados genéticamente15,,16. Este protocolo permite a los investigadores sin habilidades avanzadas de manipulación de embriones generar rápidamente modelos animales de enfermedades humanas con alta eficiencia. El protocolo también reduce significativamente los desafíos prácticos en la generación de ratones modificados genéticamente, como la heterogeneidad genética en los fundadores16. Para superar el mosaico, realizamos la electroporación de reactivos CRISPR dentro de 1 h después de la descongelación del embrión para asegurar que la edición se produce antes de la primera replicación del genoma. Otra mejora incluye el uso de proteína Cas9 en lugar de ARNm Cas9 para reducir el mosaico indeseable17. Además, desarrollamos un método óptimo para la criopreservación de embriones de una célula que aumenta la tasa de desarrollo a la etapa de dos células16:el uso de suero bovino fetal (FBS) mejora dramáticamente la supervivencia de los ovocitos liofilizados después de la fertilización, tal vez por el mismo mecanismo que hace que los ovocitos no fecundos liofilizados sean más resistentes18.

Aquí presentamos un protocolo integral para la generación de ratones modificados genéticamente utilizando embriones liofilizados, incluyendo el método modificado para la criopreservación de embriones C57BL/6J de una célula. Incluye 1) diseño de gRNA, preparación y montaje de reactivos CRISPR; 2) FIV, criopreservación y descongelación de embriones unicelulares; 3) Electroporación de reactivos CRISPR en embriones liofilconantes descongelados; 4) Transferencia de embriones al oviducto de ratones hembra pseudoembarazada; y 5) Genotipado y análisis de secuencia de los animales fundadores de F0.

Protocol

Todos los cuidados y procedimientos de animales realizados en este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con las reglas y reglamentos de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Cuidado Animal de Animales de Laboratorio de la Universidad de Toyama, la Universidad de Tokio, la Universidad De Jichi y el Instituto Max Planck Florida para Neurociencia. La información sobre todos los reactivos se muestra en la Tabla de Materiales….

Representative Results

Nuestro método modificado para la criopreservación de embriones unicelulares, incluida la incubación en HTF que contiene 20% de FBS durante 10 minutos seguido de criopreservación en 1 M DMSO y DAP213 solución, mejoró la tasa de desarrollo de los embriones de congelación descongelado en la etapa de dos células(Figura 1, p – 0.009, Prueba t del estudiante). Los embriones liofiluñas congeladas se utilizaron para la producción de ratones modificados genéticamente y se optimizaron las …

Discussion

El protocolo descrito permite la generación de ratones modificados genéticamente con alta eficiencia y bajas tasas de mosaico(Tabla 1). Permite a los investigadores sin habilidades avanzadas de manipulación de embriones crear ratones mutantes fácilmente porque aprovecha los últimos y más útiles avances en ingeniería reproductiva y tecnologías de edición del genoma: ribonucleoprotein (RNP) CRISPR/Cas9 y electroporación en embriones de congelación descongelación. Estos avances facilitaron y ag…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Queremos agradecer a Hitomi Sawada y Elizabeth García por el cuidado de los animales. Este trabajo fue apoyado por KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 y 16K01946) y Hokugin Research Grant (a H.N.), y Jichi Medical University Young Investigator Award (a H.U.). La Fundación de Becas Otsuka Toshimi apoyó a M.D.

Materials

0.25 M Sucrose ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) SUCROSE
1 M DMSO ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) 1M DMSO
Butorphanol Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan) Vetorphale 5mg
Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) 1081060
C57BL/6J mice Japan SLC (Hamamatsu, Japan) N/A
DAP213 ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) DAP213
FBS Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) ES-009-C
hCG MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan) HCG Mochida 3000
HTF ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) HTF
ICR mice Japan SLC (Hamamatsu, Japan) N/A
Isoflurane Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO) 07-893-1389
KSOM ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) KSOM
LN2 Tank Chart Industries (Ball Ground, GA) XC 34/18
M2 ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) M2
Medetomidine Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan) 1124401A1060
Microscope Nikon Co. (Tokyo, Japan) SMZ745T
Midazolam Sandoz K.K. (Tokyo, Japan) 1124401A1060
Nuclease free buffer Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) 1072570
Nucleospin DNA extraction kit Takara Bio Inc (Kusatsu, Japan) 740952 .5
One-hole slide glass Matsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan) S339929
One-step type Electroporator BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) CUY21EDIT II
Paraffin Liquid NACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan) SP 26137-85
Platinum plate electrode BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) LF501PT1-10, GE-101
PMSG ASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan) SEROTROPIN 1000
Povidone iodide Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY) C12400
Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM I Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) 22600134
Two-step type Electroporator Nepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan) NEPA21

References

  1. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA – guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-822 (2012).
  3. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  4. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/VCas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  5. Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  6. Mashiko, D., et al. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
  7. Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Developmental Biology. 393 (1), 3-9 (2014).
  8. Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS ONE. 10 (11), 1-7 (2015).
  9. Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).
  10. Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
  11. Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
  12. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
  13. Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
  14. Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
  15. Nakagawa, Y., et al. Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-10 (2015).
  16. Darwish, M., et al. Rapid and high-efficient generation of mutant mice using freeze-thawed embryos of the C57BL/6J strain. Journal of Neuroscience Methods. 317, 149-156 (2019).
  17. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
  18. Sakamoto, W., Kaneko, T., Nakagata, N. Use of frozen-thawed oocytes for efficient production of normal offspring from cryopreserved mouse spermatozoa showing low fertility. Comparative Medicine. 55 (2), 136-139 (2005).
  19. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: Software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
  20. Torres-Perez, R., Garcia-Martin, J. A., Montoliu, L., Oliveros, J. C., Pazos, F. WeReview: CRISPR Tools-Live Repository of Computational Tools for Assisting CRISPR/Cas Experiments. Bioengineering. 6 (3), 63 (2019).
  21. Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 4811 (2019).
  22. Takeo, T., Nakagata, N. Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice. PLoS ONE. 10 (5), 1-11 (2015).
  23. Wuri, L., Agca, C., Agca, Y. Euthanasia via CO2 inhalation causes premature cortical granule exocytosis in mouse oocytes and influences in vitro fertilization and embryo development. Molecular Reproduction and Development. 86 (7), 825-834 (2019).
  24. Nakagata, N. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. Journal of Reproduction and Fertility. 87 (2), 479-483 (1989).
  25. Dehairs, J., Talebi, A., Cherifi, Y., Swinnen, J. V. CRISP-ID: Decoding CRISPR mediated indels by Sanger sequencing. Scientific Reports. 6, 28973 (2016).
  26. Nakagawa, Y., Sakuma, T., Takeo, T., Nakagata, N., Yamamoto, T. Electroporation-mediated genome editing in vitrified/warmed mouse zygotes created by ivf via ultra-superovulation. Experimental Animals. 67 (4), 535-543 (2018).
  27. Nakajima, K., Nakajima, T., Takase, M., Yaoita, Y. Generation of albino Xenopus tropicalis using zinc-finger nucleases. Development Growth and Differentiation. 54 (9), 777-784 (2012).
  28. Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34, 807-808 (2016).
  29. Dumeau, C. E., et al. Introducing gene deletions by mouse zygote electroporation of Cas12a/Cpf1. Transgenic Research. 28 (5-6), 525-535 (2019).
  30. Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient Generation of Knockin Mice by CRISPR RNP Electroporation and AAV Donor Infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
  31. Mizuno, N., et al. Intra-embryo Gene Cassette Knockin by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing with Adeno-Associated Viral Vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  32. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly Efficient RNA-guide genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  33. Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
  34. Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct Roles of RZZ and Bub1-KNL1 in Mitotic Checkpoint Signaling and Kinetochore Expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
  35. Smits, A. H., et al. Biological Plasticity Rescues Target Activity in CRISPR Knockouts. Nature Methods. 16, 1087-1093 (2019).

Play Video

Cite This Article
Nishizono, H., Darwish, M., Uosaki, H., Masuyama, N., Seki, M., Abe, H., Yachie, N., Yasuda, R. Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice. J. Vis. Exp. (158), e60808, doi:10.3791/60808 (2020).

View Video