Summary

Verwendung von gefriergetauten Embryonen für die hocheffiziente Produktion von gentechnisch veränderten Mäusen

Published: April 02, 2020
doi:

Summary

Hier stellen wir eine modifizierte Methode zur Kryokonservierung von Einzellembryonen sowie ein Protokoll vor, das die Verwendung von gefriergetauten Embryonen und Elektroporation für die effiziente Erzeugung genetisch veränderter Mäuse koppelt.

Abstract

Die Verwendung von gentechnisch veränderten (GV) Mäusen ist entscheidend für das Verständnis der Genfunktion und die Entschlüsselung der zugrunde liegenden Mechanismen menschlicher Krankheiten geworden. Das CRISPR/Cas9-System ermöglicht es Forschern, das Genom mit beispielloser Effizienz, Genauigkeit und Einfachheit zu modifizieren. Mit dieser Technologie suchen Forscher nach einem schnellen, effizienten und einfachen Protokoll zur Erzeugung von GV-Mäusen. Hier führen wir eine verbesserte Methode zur Kryokonservierung von Einzellembryonen ein, die zu einer höheren Entwicklungsrate der gefrierenden Embryonen führt. Durch die Kombination mit optimierten Elektroporationsbedingungen ermöglicht dieses Protokoll die Erzeugung von Knockout- und Knock-in-Mäusen mit hoher Effizienz und niedrigen Mosaikraten innerhalb kurzer Zeit. Darüber hinaus zeigen wir eine schritt weise Erklärung unseres optimierten Protokolls, das die CRISPR-Reagenzpräparation, In-vitro-Fertilisation, Kryokonservierung und das Auftauen von einzelligen Embryonen, die Elektroporation von CRISPR-Reagenzien, die Mausgenerierung und die Genotypisierung der Gründer umfasst. Mit diesem Protokoll sollten Forscher in der Lage sein, gentechnisch veränderte Mäuse mit beispielloser Leichtigkeit, Geschwindigkeit und Effizienz vorzubereiten.

Introduction

Das gruppierte, regelmäßig interspaceierte kurzpalädime Wiederholungen (CRISPR)/CRISPR-assoziiertes Protein 9 (Cas9) System ist ein wissenschaftlicher Durchbruch, der eine beispiellose gezielte Modifikation im Genom1ermöglicht. Das CRISPR/Cas9-System besteht aus Cas9-Protein und Guide-RNA (gRNA) mit zwei molekularen Komponenten: einer zielspezifischen CRISPR-RNA (crRNA) und einer transaktivierenden CRISPR-RNA (tracrRNA)2 . Eine gRNA leitet das Cas9-Protein auf den spezifischen Ort im Genom, 20 Nukleotide, die crRNA ergänzen, und neben dem protospacer angrenzenden Motiv (PAM). Das Cas9-Protein bindet an die Zielsequenz und induziert Doppelstrangbrüche (DSBs), die entweder durch fehleranfällige nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) oder High-Fidelity-Homologie-gesteuerte Reparatur (HDR)3,4,5repariert werden. Das NHEJ führt zu Einfügungen oder/und Deletionen (Indels) und damit zu einem Genverlust der Funktion, wenn eine Codierungssequenz angepeilt wird. Die HDR führt zu einer präzisen Genombearbeitung in Gegenwart einer Reparaturvorlage, die Homologiesequenzen3,4,5enthält. Die NHEJ und HDR wurden genutzt, um Knockout- bzw. Knock-in-Mäuse zu erzeugen.

Während das CRISPR/Cas9-System die Erzeugung von GV-Mäusen mit herausragender Wirksamkeit und Genauigkeit deutlich beschleunigt hat, stehen Wissenschaftler, die diese Methoden anwenden, oft vor technischen Herausforderungen. Erstens erfordern herkömmliche Protokolle eine Mikroinjektion für die Einführung der CRISPR-Bearbeitungswerkzeuge in den Vorkern befruchteter Eier6,7. Diese Technik ist zeitaufwändig und erfordert in der Regel eine umfangreiche Schulung. So ersetzten mehrere Gruppen die Mikroinjektion durch Elektroporation8,9,10,11,12,13. In den frühen Elektroporationsprotokollen wurden jedoch frische Embryonen für die Elektroporation verwendet. Dies verursachte ein weiteres Problem, denn die Vorbereitung frischer Embryonen vor jedem Experiment ist schwierig14.

Kürzlich haben wir und andere die Verwendung von gefriergetauten Embryonen und Elektroporation für die Genombearbeitung kombiniert, was die Erzeugung von GV-Mäusen15,16erleichtert. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern ohne fortgeschrittene Embryo-Manipulationsfähigkeiten, schnell Tiermodelle menschlicher Krankheiten mit hoher Effizienz zu generieren. Das Protokoll reduziert auch die praktischen Herausforderungen bei der Erzeugung von GV-Mäusen, wie z. B. genetische Heterogenität in den Gründern16. Um den Mosaikismus zu überwinden, führen wir die Elektroporation von CRISPR-Reagenzien innerhalb von 1 h nach dem Auftauen des Embryos durch, um sicherzustellen, dass die Bearbeitung vor der ersten Replikation des Genoms erfolgt. Eine weitere Verbesserung beinhaltet die Verwendung von Cas9-Protein anstelle von Cas9 mRNA, um unerwünschten Mosaikismus zu reduzieren17. Darüber hinaus haben wir eine optimale Methode für die Einzell-Embryo-Kryokonservierung entwickelt, die die Entwicklungsrate auf das Zweizellstadium16erhöht: Die Verwendung von fetalem Rinderserum (FBS) verbessert das Überleben gefriergetauter Eizellen nach der Befruchtung dramatisch, vielleicht durch denselben Mechanismus, der gefriertaute unbefruchtete Eizellen widerstandsfähiger macht18.

Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll zur Erzeugung von gentechnisch veränderten Mäusen mit gefriergetgetgetatten Embryonen vor, einschließlich der modifizierten Methode zur Kryokonservierung von einzelligen C57BL/6J-Embryonen. Es umfasst 1) gRNA-Design, CRISPR-Reagenzvorbereitung und -montage; 2) IVF, Kryokonservierung und Auftauen von Einzell-Embryonen; 3) Elektroporation von CRISPR-Reagenzien in gefriergettaute Embryonen; 4) Embryotransfer in das Eileiter von pseudoschwangeren weiblichen Mäusen; und 5) Genotypisierung und Sequenzanalyse der F0-Gründertiere.

Protocol

Alle in dieser Studie durchgeführten Tierpflege und -verfahren wurden gemäß den Regeln und Vorschriften des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Das experimentelle Protokoll wurde vom Animal Care Committee of Laboratory Animals der University of Toyama, der University of Tokyo, der Jichi University und dem Max-Planck-Florida-Institut für Neurowissenschaften genehmigt. Informationen über alle Reagenzien finden Sie in der Materialtabelle. 1…

Representative Results

Unsere modifizierte Methode zur Kryokonservierung von Einzellembryonen, einschließlich der Inkubation in HTF mit 20% FBS für 10 min gefolgt von Kryokonservierung in 1 M DMSO und DAP213 Lösung, verbesserte die Entwicklungsrate der gefriertauten Embryonen in das Zweizellstadium(Abbildung 1, p = 0,009, Student es t-Test). Die gefriertauten Embryonen wurden zur Herstellung von gentechnisch veränderten Mäusen verwendet und elektroporationsbedingungen optimiert: fünf Wiederholungen von 25 V …

Discussion

Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Erzeugung von GV-Mäusen mit hoher Effizienz und niedrigen Mosaikraten (Tabelle 1). Es ermöglicht Forschern ohne fortgeschrittene Embryo-Manipulationsfähigkeiten, mutierte Mäuse leicht zu erstellen, da sie die neuesten und nützlichsten Fortschritte sowohl in der Reproduktionstechnik als auch in den Genom-Editing-Technologien nutzen: CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein (RNP) und Elektroporation in gefriergettaute Embryonen. Diese Fortschritte erleichterten und besc…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Hitomi Sawada und Elizabeth Garcia für die Tierpflege. Diese Arbeit wurde von KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 und 16K01946) und Hokugin Research Grant (an H.N.) und Jichi Medical University Young Investigator Award (nach H.U.) unterstützt. Die Otsuka Toshimi Scholarship Foundation unterstützte M.D.

Materials

0.25 M Sucrose ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) SUCROSE
1 M DMSO ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) 1M DMSO
Butorphanol Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan) Vetorphale 5mg
Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) 1081060
C57BL/6J mice Japan SLC (Hamamatsu, Japan) N/A
DAP213 ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) DAP213
FBS Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) ES-009-C
hCG MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan) HCG Mochida 3000
HTF ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) HTF
ICR mice Japan SLC (Hamamatsu, Japan) N/A
Isoflurane Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO) 07-893-1389
KSOM ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) KSOM
LN2 Tank Chart Industries (Ball Ground, GA) XC 34/18
M2 ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) M2
Medetomidine Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan) 1124401A1060
Microscope Nikon Co. (Tokyo, Japan) SMZ745T
Midazolam Sandoz K.K. (Tokyo, Japan) 1124401A1060
Nuclease free buffer Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) 1072570
Nucleospin DNA extraction kit Takara Bio Inc (Kusatsu, Japan) 740952 .5
One-hole slide glass Matsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan) S339929
One-step type Electroporator BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) CUY21EDIT II
Paraffin Liquid NACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan) SP 26137-85
Platinum plate electrode BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) LF501PT1-10, GE-101
PMSG ASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan) SEROTROPIN 1000
Povidone iodide Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY) C12400
Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM I Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) 22600134
Two-step type Electroporator Nepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan) NEPA21

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Nishizono, H., Darwish, M., Uosaki, H., Masuyama, N., Seki, M., Abe, H., Yachie, N., Yasuda, R. Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice. J. Vis. Exp. (158), e60808, doi:10.3791/60808 (2020).

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