Gebruik van gevriesde embryo's voor hoogrendementproductie van genetisch gemodificeerde muizen
Summary
Hier presenteren we een aangepaste methode voor cryopreservatie van eencellige embryo’s, evenals een protocol dat het gebruik van gevriesontdooide embryo’s en elektroporatie koppelt voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen.
Abstract
Het gebruik van genetisch gemodificeerde (GM) muizen is cruciaal geworden voor het begrijpen van de genfunctie en het ontcijferen van de onderliggende mechanismen van menselijke ziekten. Het CRISPR/Cas9-systeem stelt onderzoekers in staat om het genoom te wijzigen met ongekende efficiëntie, trouw en eenvoud. Gebruikmakend van deze technologie, onderzoekers zijn op zoek naar een snelle, efficiënte en eenvoudige protocol voor het genereren van GM muizen. Hier introduceren we een verbeterde methode voor cryopreservatie van eencellige embryo’s die leidt tot een hogere ontwikkelingsgraad van de invriesontdooide embryo’s. Door het te combineren met geoptimaliseerde elektroporatieomstandigheden, maakt dit protocol het mogelijk om binnen korte tijd knock-out- en knock-in muizen te genereren met een hoog rendement en lage mozaïeksnelheden. Verder tonen we een stapsgewijze uitleg van ons geoptimaliseerde protocol, dat betrekking heeft op CRISPR reagensvoorbereiding, in vitro fertilisatie, cryopreservatie en ontdooiing van eencellige embryo’s, elektroporatie van CRISPR-reagentia, muisgeneratie en genotypering van de oprichters. Met behulp van dit protocol moeten onderzoekers gm-muizen met ongeëvenaard gemak, snelheid en efficiëntie kunnen voorbereiden.
Introduction
Het geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische repeats (CRISPR)/CRISPR-geassocieerd eiwit 9 (Cas9) systeem is een wetenschappelijke doorbraak die ongekende gerichte modificatie in het genoom1biedt. Het CRISPR/Cas9 systeem bestaat uit Cas9 eiwit- en gidsRNA (gRNA) met twee moleculaire componenten: een doelspecifiek CRISPR RNA (crRNA) en een transactiverend CRISPR RNA (tracrRNA)2 . Een gRNA stuurt het Cas9-eiwit naar de specifieke locus in het genoom, 20 nucleotiden complementair aan crRNA en grenzend aan het protospacer aangrenzende motief (PAM). Het Cas9-eiwit bindt zich aan de doelsequentie en induceert dubbele strengbreuken (DSB’s) die worden gerepareerd door ofwel foutgevoelige nonhomologe end joining (NHEJ) of high fidelity homologie-gerichte reparatie (HDR)3,4,5. NHEJ leidt tot invoegingen of/en schrappingen (indels), en vandaar tot genverlies van functie wanneer een codageopeenvolging wordt gericht. De HDR leidt tot nauwkeurige genoombewerking in aanwezigheid van een reparatiesjabloon met homologiesequenties3,4,5. De NHEJ en HDR zijn ingezet om respectievelijk knock-out- en knock-in muizen te genereren.
Terwijl het CRISPR/Cas9-systeem de generatie GM-muizen met een uitstekende werkzaamheid en trouw aanzienlijk heeft versneld, stuiten wetenschappers die deze methoden toepassen vaak op technische uitdagingen. Ten eerste vereisen conventionele protocollen micro-injectie voor de introductie van de CRISPR-bewerkingsinstrumenten in de kern van bevruchte eieren6,7. Deze techniek is tijdrovend en vereist meestal uitgebreide training. Zo vervingen verschillende groepen micro-injectie door elektroporatie8,9,10,11,12,13. In de vroege elektroporatieprotocollen werden echter verse embryo’s gebruikt voor elektroporatie. Dit veroorzaakte een ander probleem, omdat het bereiden van verse embryo’s voor elk experiment moeilijk is14.
Onlangs hebben wij en anderen het gebruik van gevriesontdooide embryo’s en elektroporatie voor genoombewerking gecombineerd, wat de generatie gm-muizen15,16vergemakkelijkt. Dit protocol stelt onderzoekers zonder geavanceerde embryomanipulatievaardigheden in staat om snel diermodellen van menselijke ziekten met een hoge efficiëntie te genereren. Het protocol vermindert ook aanzienlijk praktische uitdagingen bij het genereren van GM muizen, zoals genetische heterogeniteit in de oprichters16. Om mosaicisme te overwinnen, voeren we de elektroporatie van CRISPR-reagentia uit binnen 1 uur na het ontdooien van embryo’s om ervoor te zorgen dat bewerking plaatsvindt vóór de eerste replicatie van het genoom. Een andere verbetering omvat het gebruik van Cas9-eiwit in plaats van Cas9 mRNA om ongewenst mozaïekisme te verminderen17. Verder ontwikkelden we een optimale methode voor eencellige embryo cryopreservatie die de ontwikkelingsgraad verhoogt tot de tweecellige fase16: het gebruik van foetaal runderserum (FBS) verbetert de overleving van vriesontdooide eicellen na de bevruchting drastisch, misschien door hetzelfde mechanisme dat bevriesde onbevruchte eicellen maakt18.
Hier presenteren we een uitgebreid protocol voor de generatie van GM muizen met behulp van gevriesontdooide embryo’s, met inbegrip van de gewijzigde methode voor cryopreservatie van eencellige C57BL/6J embryo’s. Het omvat 1) gRNA-ontwerp, CRISPR reagensvoorbereiding en montage; 2) IVF, cryopreservatie en ontdooiing van embryo’s uit één cel; 3) Elektroporatie van CRISPR-reagentia in ontdooide embryo’s; 4) Embryotransfer in het eicel van pseudozwangere vrouwelijke muizen; en 5) Genotypering en sequentieanalyse van de F0-oprichtersdieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het beschreven protocol maakt het mogelijk voor de generatie van GM muizen met een hoog rendement en lage mozaïek tarieven (Tabel 1). Het stelt onderzoekers zonder geavanceerde embryomanipulatievaardigheden in staat om mutantmuizen gemakkelijk te maken omdat het gebruik maakt van de nieuwste en meest nuttige vooruitgang in zowel reproductieve engineering- als genoombewerkingstechnologieën: CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) en elektroporatie in gevriesde embryo’s. Deze vooruitgang vergemakkelijkte en …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Hitomi Sawada en Elizabeth Garcia bedanken voor de verzorging van dieren. Dit werk werd ondersteund door KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 en 16K01946) en Hokugin Research Grant (naar H.N.), en Jichi Medical University Young Investigator Award (naar H.U.). De Otsuka Toshimi Scholarship Foundation steunde MD.
Materials
| 0.25 M Sucrose | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | SUCROSE | |
| 1 M DMSO | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | 1M DMSO | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | Vetorphale 5mg | |
| Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1081060 | |
| C57BL/6J mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| DAP213 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | DAP213 | |
| FBS | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | ES-009-C | |
| hCG | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan) | HCG Mochida 3000 | |
| HTF | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | HTF | |
| ICR mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| Isoflurane | Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO) | 07-893-1389 | |
| KSOM | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | KSOM | |
| LN2 Tank | Chart Industries (Ball Ground, GA) | XC 34/18 | |
| M2 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | M2 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan) | 1124401A1060 | |
| Microscope | Nikon Co. (Tokyo, Japan) | SMZ745T | |
| Midazolam | Sandoz K.K. (Tokyo, Japan) | 1124401A1060 | |
| Nuclease free buffer | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1072570 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | Takara Bio Inc (Kusatsu, Japan) | 740952 .5 | |
| One-hole slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan) | S339929 | |
| One-step type Electroporator | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | CUY21EDIT II | |
| Paraffin Liquid | NACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan) | SP 26137-85 | |
| Platinum plate electrode | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | LF501PT1-10, GE-101 | |
| PMSG | ASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan) | SEROTROPIN 1000 | |
| Povidone iodide | Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY) | C12400 | |
| Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM I | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | 22600134 | |
| Two-step type Electroporator | Nepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan) | NEPA21 |
References
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA – guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-822 (2012).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/VCas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Mashiko, D., et al. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Developmental Biology. 393 (1), 3-9 (2014).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS ONE. 10 (11), 1-7 (2015).
- Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
- Nakagawa, Y., et al. Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-10 (2015).
- Darwish, M., et al. Rapid and high-efficient generation of mutant mice using freeze-thawed embryos of the C57BL/6J strain. Journal of Neuroscience Methods. 317, 149-156 (2019).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
- Sakamoto, W., Kaneko, T., Nakagata, N. Use of frozen-thawed oocytes for efficient production of normal offspring from cryopreserved mouse spermatozoa showing low fertility. Comparative Medicine. 55 (2), 136-139 (2005).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: Software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
- Torres-Perez, R., Garcia-Martin, J. A., Montoliu, L., Oliveros, J. C., Pazos, F. WeReview: CRISPR Tools-Live Repository of Computational Tools for Assisting CRISPR/Cas Experiments. Bioengineering. 6 (3), 63 (2019).
- Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 4811 (2019).
- Takeo, T., Nakagata, N. Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice. PLoS ONE. 10 (5), 1-11 (2015).
- Wuri, L., Agca, C., Agca, Y. Euthanasia via CO2 inhalation causes premature cortical granule exocytosis in mouse oocytes and influences in vitro fertilization and embryo development. Molecular Reproduction and Development. 86 (7), 825-834 (2019).
- Nakagata, N. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. Journal of Reproduction and Fertility. 87 (2), 479-483 (1989).
- Dehairs, J., Talebi, A., Cherifi, Y., Swinnen, J. V. CRISP-ID: Decoding CRISPR mediated indels by Sanger sequencing. Scientific Reports. 6, 28973 (2016).
- Nakagawa, Y., Sakuma, T., Takeo, T., Nakagata, N., Yamamoto, T. Electroporation-mediated genome editing in vitrified/warmed mouse zygotes created by ivf via ultra-superovulation. Experimental Animals. 67 (4), 535-543 (2018).
- Nakajima, K., Nakajima, T., Takase, M., Yaoita, Y. Generation of albino Xenopus tropicalis using zinc-finger nucleases. Development Growth and Differentiation. 54 (9), 777-784 (2012).
- Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34, 807-808 (2016).
- Dumeau, C. E., et al. Introducing gene deletions by mouse zygote electroporation of Cas12a/Cpf1. Transgenic Research. 28 (5-6), 525-535 (2019).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient Generation of Knockin Mice by CRISPR RNP Electroporation and AAV Donor Infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo Gene Cassette Knockin by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing with Adeno-Associated Viral Vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly Efficient RNA-guide genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
- Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct Roles of RZZ and Bub1-KNL1 in Mitotic Checkpoint Signaling and Kinetochore Expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
- Smits, A. H., et al. Biological Plasticity Rescues Target Activity in CRISPR Knockouts. Nature Methods. 16, 1087-1093 (2019).
