Uso de embriões congelados para produção de ratos geneticamente modificados

O sistema de repetições palindrômicas curtas interespaçadas regularmente interespaçadas (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) é um avanço científico que proporciona uma modificação direcionada sem precedentes no genoma¹. O sistema CRISPR/Cas9 é composto por proteína Cas9 e rna guia (gRNA) com dois componentes moleculares: um RNA CRISPR específico para alvo (crRNA) e um RNA CRISPR transativador (tracrNA)² . Um gRNA direciona a proteína Cas9 para o lócus específico no genoma, 20 nucleotídeos complementares ao crRNA, e adjacentes ao protoespaço adjacente (PAM). A proteína Cas9 liga-se à seqüência de destino e induz quebras de fios duplos (DSBs) que são reparadas por uma junção final não homologo (NHEJ) propensa a erros ou reparação dirigida à homologia de alta fidelidade (HDR)^3,,4,5. O NHEJ leva a inserções ou/e exclusões (indels) e, portanto, à perda genética da função quando uma seqüência de codificação é direcionada. O HDR leva à edição precisa do genoma na presença de um modelo de reparo contendo seqüências de homologia^3,4,5. O NHEJ e o HDR foram aproveitados para gerar nocaute e knock-in, respectivamente.

Embora o sistema CRISPR/Cas9 tenha acelerado significativamente a geração de ratos GM com excelente eficácia e fidelidade, cientistas que aplicam esses métodos frequentemente encontram desafios técnicos. Em primeiro lugar, os protocolos convencionais requerem microinjeção para introduzir as ferramentas de edição CRISPR no pronúcleo de ovos fertilizados^6,7. Essa técnica é demorada e geralmente requer treinamento extensivo. Assim, vários grupos substituíram a microinjeção por eletroporação^{88,9,10,,11,12,13}. No entanto, nos primeiros protocolos de eletroporação foram utilizados embriões frescos para eletroporação. Isso causou outro problema, pois preparar embriões frescos antes de cada experimento é difícil¹⁴.

Recentemente, nós e outros combinamos o uso de embriões congelados e eletroporação para edição de genomas, o que facilita a geração de camundongos GM^15,16. Este protocolo permite que pesquisadores sem habilidades avançadas de manipulação de embriões gerem rapidamente modelos animais de doenças humanas com alta eficiência. O protocolo também reduz significativamente os desafios práticos na geração de camundongos GM, como a heterogeneidade genética nos fundadores¹⁶. Para superar o mosaico, realizamos a eletroporação dos reagentes CRISPR dentro de 1h após o descongelamento do embrião para garantir que a edição ocorra antes da primeira replicação do genoma. Outra melhoria inclui o uso da proteína Cas9 em vez de Cas9 mRNA para reduzir o mosaico indesejável¹⁷. Além disso, desenvolvemos um método ideal para criopreservação de embriões unicelulares que aumenta a taxa de desenvolvimento para o estágio¹⁶de duas células : o uso de soro bovino fetal (FBS) melhora drasticamente a sobrevivência de oócitos congelados após a fertilização, talvez pelo mesmo mecanismo que torna os oócitos não fertilizados congelados mais resistentes¹⁸.

Aqui apresentamos um protocolo abrangente para a geração de camundongos GM usando embriões congelados, incluindo o método modificado para criopreservação de embriões C57BL/6J de células únicas. Inclui 1) design gRNA, preparação e montagem de reagentes CRISPR; 2) FIV, criopreservação e descongelamento de embriões unicelulares; 3) Eletroporização dos reagentes CRISPR em embriões congelados; 4) Transferência de embriões para o oviduto de camundongos pseudogestantes; e 5) Genotipagem e análise de seqüência dos animais fundadores do F0.