Summary

Kafa Uzayı Gaz Kromatografisi Kullanan ZebraBalığı Embriyolarında Etanol Düzeylerinin Ölçülmesi

Published: February 11, 2020
doi:

Summary

Bu çalışma, uygun maruzkalma yöntemlerinden embriyo işleme ve etanol analizine kadar kafa uzayı gaz kromatografisi kullanarak zebra balığı embriyosundaki etanol düzeylerini ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır.

Abstract

Fetal Alkol Spektrum Bozuklukları (FASD), yüz dismorfolojileri ve nörolojik bozukluklar da dahil olmak üzere etanol kaynaklı gelişimsel defektlerin son derece değişken bir sürekliliğini tanımlar. Karmaşık bir patoloji ile, FASD her yıl Amerika Birleşik Devletleri’nde doğan her 100 çocuktan yaklaşık 1’ini etkiler. FASD’nin son derece değişken doğası nedeniyle, hayvan modelleri etanol kaynaklı gelişim kusurları mevcut mekanistik anlayış kritik kanıtlamıştır. Laboratuvarların giderek artan sayıda etanol kaynaklı gelişimsel kusurları incelemek için zebra balığı kullanarak odaklanmıştır. Zebra balıkları çok sayıda dıştan döllenmiş, genetik olarak çıkarılabilir, yarı saydam embriyo üretirler. Bu araştırmacılar tam olarak zamanlaması ve birden fazla genetik bağlamda etanol maruziyetinin dozajını kontrol etmek ve canlı görüntüleme teknikleri ile embriyonik etanol maruziyetinin etkisini ölçmek için izin verir. Bu, insanlar ile hem genetik ve gelişme koruma yüksek derecede ile birlikte, hangi etanol teratojenite mekanistik temeli çalışma için güçlü bir model olduğu zebra balığı kanıtlamıştır. Ancak, etanol maruziyetrejimleri bu çalışmalar arasında zebra balığı verilerinin yorumlanması şaşırttı farklı zebra balığı çalışmaları arasında farklılık göstermiştir. Burada kafa uzayı gaz kromatografisi kullanarak zebra balığı embriyolarında etanol konsantrasyonları ölçmek için bir protokoldür.

Introduction

Fetal Alkol Spektrum Bozuklukları (FASD) nörolojik bozukluklar ve embriyonik etanol maruziyeti ile ilişkili kraniyofasiyal dismorfolojileri geniş bir dizi açıklar1. Birden fazla faktör, zamanlama ve etanol maruziyeti ve genetik arka plan dozajı da dahil olmak üzere, FASD varyasyonkatkıda2,3. İnsanlarda, bu değişkenlerin karmaşık ilişkisi, FASD’nin etyolojisini incelemeyi ve anlamayı zorlaştırır. Hayvan modelleri etanol teratojenite mekanistik temelanlayışımızı geliştirmede önemli olduğunu kanıtlamıştır. Hayvan modeli sistemleri geniş bir yelpazede FASD birden fazla yönünü incelemek için kullanılmıştır ve sonuçlar son derece insanlarda maruz kalma bulunan ne ile tutarlı olmuştur4. Kemirgen model sistemleri FASD birçok yönünü incelemek için kullanılır, fareler en yaygın olan5,6,7. Bu çalışmanın çoğunluğu erken etanol maruziyeti gelişimsel bozukluklar üzerinde duruldu8, daha sonra etanol maruz ilikal anomalilere neden olduğu gösterilmiştir rağmen9. Ayrıca, farelerin genetik yetenekleri büyük ölçüde FASD10,11genetik temelleri araştırmak için yeteneğimizi yardımcı olmuştur. Farelerde bu çalışmalar kuvvetle sonik kirpi yolu ile gen-etanol etkileşimleri olduğunu göstermektedir, retinoik asit sinyalizasyonu, Süperoksit dismutaz, Nitrik oksit synthase I, Aldh2 ve Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Bu çalışmalar, hayvan modellerinin FASD ve onun altında yatan mekanizmaları anlamamızı ilerletmek için kritik öneme sahip olduğunu göstermektedir.

Zebra balığı etanol teratogenez22,23birçok yönünü incelemek için güçlü bir model sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Dış döllenme, yüksek fecundity, genetik sedatability ve canlı görüntüleme yetenekleri nedeniyle, zebrabalığı ideal zamanlama, dozaj ve etanol teratogenez genetik gibi faktörlerir çalışma için uygundur. Etanol tam olarak sahnelenen embriyolar için uygulanabilir ve embriyolar daha sonra gelişimsel süreçler sırasında etanol doğrudan etkisini incelemek için görüntülenebilir. Bu çalışma doğrudan insanlarla ilgili olabilir, çünkü genetik gelişim programları zebra balığı ve insanlar arasında son derece korunur ve bu nedenle FASD insan çalışmaları24rehberlik yardımcı olabilir. Zebra balığı etanol teratogenezini incelemek için kullanılırken, embriyonik etanol konsantrasyonlarının raporlanmasında konsensüs eksikliği insanlara kıyasla zor25. Memeli sistemlerinde, kan-alkol düzeyleri doku etanol düzeyleri ile doğrudan ilişkilidir26. Zebra balıklarının çoğu, dolaşım sistemleri tam olarak oluşmadan önce embriyoları tedavi eder. İncelemek için hiçbir anne örneği ile, embriyo içinde etanol düzeylerini ölçmek için etanol konsantrasyonlarını değerlendirmek için bir süreç gereklidir. Burada kafa uzayı gaz kromatografisi kullanarak gelişmekte olan bir zebra balığı embriyosundaki etanol konsantrasyonlarını ölçmek için bir süreç anlatıyoruz.

Protocol

Bu işlemde kullanılan tüm zebra balığı embriyoları, kurulan IACUC protokolleri27’yegöre yükseltildi ve yetiştirildi. Bu protokoller Austin’deki Texas Üniversitesi ve Louisville Üniversitesi tarafından onaylandı. NOT: Bu çalışmada zebra balığı hattı Tg(fli1:EGFP)y1 kullanılmıştır28. Bu işlemde kullanılan tüm su steril ters ozmoz suyudur. Tüm istatistiksel analizler Graphpad Prism v8.2.1 kullanılar…

Representative Results

Kan etanol düzeyleri erken embriyonik zebra balıklarında belirlenemez, çünkü tam olarak oluşmuş bir dolaşım sistemi vardır. Zebra balığı embriyolarında etanol konsantrasyonu düzeyini belirlemek için, etanol düzeyleri doğrudan homojenize embriyonik doku dan ölçülür. Düzgün embriyonik etanol konsantrasyonları ölçmek için, embriyonik hacim dikkate alınmalıdır. Embriyo (sarısı ekli) ekstraembriyonik sıvı ile çevrili chorion (yumurta kabuğu) içinde oturur(Şekil 1).<…

Discussion

Gelişimsel bir model sistemi olarak, zebra balıkları çevresel faktörlerin gelişim üzerindeki etkisini incelemek için idealdir. Onlar etanol çalışmalarında kesin zamanlama ve dozaj paradigmaları sağlar dıştan döllenmiş embriyolar, çok sayıda üretmek. Bu, canlı görüntüleme yetenekleri ve insanlar ile genetik ve gelişimsel koruma ile birlikte, zebra balığı teratoloji çalışmaları için güçlü bir model sistemi yapmak. Açıklanan kafa uzayı gaz kromatografisi kullanarak zebra balığı emb…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu makalede sunulan araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri/Ulusal Diş ve Kraniyofasiyal Araştırma Enstitüsü (NIH/NIDCR) R01DE020884’ten J.K.E.’ye daha önce verilen hibelerle desteklenmiştir. ve Ulusal Sağlık Enstitüleri/Ulusal Alkol Bağımlılığı ve Alkolizm Enstitüsü (NIH/NIAAA) F32AA021320’den C.B.L.’ye ve Ulusal Sağlık Enstitüleri/Ulusal Alkol Bağımlılığı Enstitüsü’nden (NIH/NIAAA) R00AA023560’dan C.B.L’ye verilen hibe. Rueben Gonzales’e gaz kromatograf analizini sağladığı ve yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Tiahna Ontiveros ve Dr. Gina Nobles’a yardım da çok teşekkür ederiz.

Materials

Air Provided by contract to the university
Analytical Balance VWR 10204-962
AutoSampler, CP-8400 Varian Gas Chromatograph Autosampler
Calcium Chloride VWR 97062-590
Ethanol Decon Labs 2701
Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL Agilent 8010-0198 Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa
Gas Chromatograph, CP-3800 Varian
Helium Provided by contract to the university
HP Innowax capillary column Agilent 19095N-123I 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick
Hyrdogen Provided by contract to the university
Magnesium Sulfate (Heptahydrate) Fisher Scientific M63-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL Fisher Scientific 2682002
Micropipette tips 10 μL Fisher Scientific 13611106
Micropipette tips 1000 μL Fisher Scientific 13611127
Micropipette tips 200 μL Fisher Scientific 13611112
Petri dishes 100 mm Fisher Scientific FB012924
Pipetman L p1000L Micropipette Gilson FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette Gilson FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette Gilson FA10001M
Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap Agilent 5190-7021 Replacement caps/septa for gas chromatograph vials
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic) VWR BDH9266-500G
Pronase VWR 97062-916
Silica Beads .5 mm Biospec Products 11079105z
Silica Beads 1.0 mm Biospec Products 11079110z
Sodium Bicarbonate VWR BDH9280-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic) Fisher Scientific S374-500
Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane Millipore Sigma 57343-U Replacement fibers
Star Chromatography Workstation Varian Chromatography software
Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa Millipore Sigma 23154 Replacement inlet septa

References

  1. Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).
  2. Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).
  3. Williams, J. F., Smith, V. C. Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders. Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).
  4. Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
  5. Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).
  6. Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice. International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).
  7. Marquardt, K., Brigman, J. L. The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models. Alcohol. 51, 1-15 (2016).
  8. Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).
  9. Lipinski, R. J., et al. Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent. PLoS One. 7 (8), 43067 (2012).
  10. Eberhart, J. K., Parnell, S. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).
  11. Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).
  12. Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).
  13. Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).
  14. Hong, M., Krauss, R. S. Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice. PLoSGenetics. 8 (10), 1002999 (2012).
  15. Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).
  16. Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome. The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).
  17. Wentzel, P., Eriksson, U. J. Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother. Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).
  18. Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).
  19. Bonthius, D. J., Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits. Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).
  20. Bonthius, D. J., et al. Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice. Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).
  21. Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).
  22. Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
  23. Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
  24. McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).
  25. Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).
  26. Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. Ethanol’s molecular targets. Science Signaling. 1 (28), (2008).
  27. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , (1993).
  28. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
  29. Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio. Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).
  30. Lippi, G., et al. The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay. Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).
  31. Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID). Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).
  32. Heit, C., et al. Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).
  33. Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector. Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).
  34. Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection. Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).
  35. Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).
  36. Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain. Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).
  37. Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time. Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).
  38. Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).
  39. Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).
  40. Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).

Play Video

Cite This Article
Lovely, C. B. Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (156), e60766, doi:10.3791/60766 (2020).

View Video