Количественная оценка уровней этанола в эмбрионах зебрафиш с использованием хроматографии космического газа головы
Summary
Эта работа описывает протокол для количественной оценки уровня этанола в эмбрионе зебры с использованием хроматографии головного космического газа от надлежащих методов воздействия на обработку эмбрионов и анализ этанола.
Abstract
Расстройства спектра фетального алкоголя (FASD) описывают весьма переменный континуум этинол-индуцированных дефектов развития, включая лицевой дисморфологии и неврологические нарушения. При сложной патологии, FASD затрагивает примерно 1 из 100 детей, родившихся в Соединенных Штатах каждый год. Из-за весьма изменчивого характера FASD, модели животных оказались критически важными в нашем нынешнем механистическом понимании дефектов развития, вызванных этанолом. Все большее число лабораторий сосредоточилось на использовании зебры для изучения дефектов развития, вызванных этанолом. Зебрафиш производит большое количество внешне оплодотворенных, генетически высохлых, полупрозрачных эмбрионов. Это позволяет исследователям точно контролировать сроки и дозировку воздействия этанола в нескольких генетических контекстах и количественно ехать воздействие воздействия эмбрионального этанола с помощью живых методов визуализации. Это, в сочетании с высокой степенью сохранения генетики и развития с людьми, оказалось, зебрафиш, чтобы быть мощной моделью, в которой для изучения механистической основы этанола тератогенности. Тем не менее, режимы воздействия этанола различаются между различными исследованиями зебры, что смущает интерпретацию данных зебры в этих исследованиях. Вот протокол для количественной оценки концентрации этанола в эмбрионах зебры с помощью хроматографии головного космического газа.
Introduction
Расстройства спектра фетального алкоголя (FASD) описывает широкий спектр неврологических нарушений и черепно-мозговых дисморфологий, связанных с воздействием эмбрионального этанола1. Несколько факторов, в том числе сроки и дозировка воздействия этанола и генетического фона, способствуют изменению FASD2,3. У людей, сложные отношения этих переменных делает изучение и понимание этиологии FASD сложной задачей. Модели животных доказали свою решающее значение в развитии нашего понимания механистической основы этанола тератогенности. Широкий спектр животных модели систем был использован для изучения нескольких аспектов FASD и результаты были удивительно в соответствии с тем, что находится в воздействии на людей4. Системы моделей грызунов используются для изучения многих аспектов FASD, с мышами, наиболее распространенными5,6,7. Большая часть этой работы была сосредоточена на дефектах развития раннего воздействия этанола8, хотя позднее воздействие этанола было показано, что причиной аномалий развития, а9. Кроме того, генетические возможности мышей в значительной степени способствовали нашей способности зондировать генетические основы FASD10,11. Эти исследования на мышах убедительно свидетельствуют о том, что существуют ген-этанол взаимодействия с звуковым пути ежа, ретиноиновая кислота сигнализации, Супероксид дисмутазы, оксида азота синтазы I, Aldh2 и Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Эти исследования показывают, что модели животных имеют решающее значение для продвижения нашего понимания FASD и ее основных механизмов.
Зебрафиш стала мощной модельной системой для изучения многих аспектов этанола тератогенеза22,23. Из-за их внешнего оплодотворения, высокой плодовитости, генетической уступчивости и возможностей живой визуализации, зебра-рыбы идеально подходят для изучения таких факторов, как время, дозировка и генетика этанола тератогенеза. Этанол может быть введен точно поставил эмбрионов и эмбрионы могут быть изображены для изучения прямого воздействия этанола во время процессов развития. Эта работа может быть связана непосредственно с людьми, потому что генетические программы развития очень сохраняются между зебрафиш и людей и поэтому может помочь руководство FASD человеческих исследований24. В то время как зебрафиш были использованы для изучения этанола тератогенеза, отсутствие консенсуса в отчетности эмбриональных концентраций этанола делает сравнение с людьми трудно25. В системах млекопитающих уровень алкоголя в крови напрямую коррелирует с уровнем этанола в тканях26. Многие исследования зебры лечат эмбрионы до полного формирования их кровеносной системы. При отсутствии материнской выборки для изучения, процесс оценки концентрации этанола необходим для количественной оценки уровня этанола в эмбрионе. Здесь мы описываем процесс количественной оценки концентраций этанола в развивающемся эмбрионе зебры с помощью хроматографии головного космического газа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Как модельная система развития, зебрабы идеально подходят для изучения влияния экологических факторов на развитие. Они производят большое количество внешне оплодотворенных эмбрионов, что позволяет точное время и дозировка парадигмы в исследованиях этанола. Это, в сочетании с живой в?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование, представленное в этой статье, было поддержано предыдущими грантами От Национальных институтов здравоохранения /Национального института стоматологических и краниофациальных исследований (NIH/NIDCR) R01DE020884 j.K.E. и Национальные институты здравоохранения/Национальный институт по злоупотреблению алкоголем и алкоголизмом (NIH/NIAAA) F32AA021320 в C.B.L. и по текущему гранту От Национальных институтов здравоохранения/Национального института по злоупотреблению алкоголем (NIH/NIAAA) R00AA023560 в C.B.L. Мы благодарим Рубена Гонсалеса за предоставление и помощь в анализе хроматографа газа. Мы благодарим Tiahna Ontiveros и д-р Джина Ноблс письменной помощи.
Materials
| Air | Provided by contract to the university | ||
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| AutoSampler, CP-8400 | Varian | Gas Chromatograph Autosampler | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL | Agilent | 8010-0198 | Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa |
| Gas Chromatograph, CP-3800 | Varian | ||
| Helium | Provided by contract to the university | ||
| HP Innowax capillary column | Agilent | 19095N-123I | 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick |
| Hyrdogen | Provided by contract to the university | ||
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Fisher Scientific | 2682002 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap | Agilent | 5190-7021 | Replacement caps/septa for gas chromatograph vials |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pronase | VWR | 97062-916 | |
| Silica Beads .5 mm | Biospec Products | 11079105z | |
| Silica Beads 1.0 mm | Biospec Products | 11079110z | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane | Millipore Sigma | 57343-U | Replacement fibers |
| Star Chromatography Workstation | Varian | Chromatography software | |
| Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa | Millipore Sigma | 23154 | Replacement inlet septa |
References
- Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).
- Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).
- Williams, J. F., Smith, V. C. Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders. Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).
- Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice. International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).
- Marquardt, K., Brigman, J. L. The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models. Alcohol. 51, 1-15 (2016).
- Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).
- Lipinski, R. J., et al. Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent. PLoS One. 7 (8), 43067 (2012).
- Eberhart, J. K., Parnell, S. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).
- Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).
- Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).
- Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).
- Hong, M., Krauss, R. S. Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice. PLoSGenetics. 8 (10), 1002999 (2012).
- Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).
- Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome. The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).
- Wentzel, P., Eriksson, U. J. Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother. Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).
- Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).
- Bonthius, D. J., Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits. Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).
- Bonthius, D. J., et al. Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice. Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).
- Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).
- Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).
- Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).
- Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. Ethanol’s molecular targets. Science Signaling. 1 (28), (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , (1993).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
- Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio. Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).
- Lippi, G., et al. The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay. Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).
- Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID). Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).
- Heit, C., et al. Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).
- Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector. Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).
- Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection. Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).
- Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).
- Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain. Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).
- Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time. Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).
- Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).
- Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).
- Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).
