Cuantificación de los niveles de etanol en embriones de pez cebra mediante cromatografía de gases del espacio de cabeza
Summary
Este trabajo describe un protocolo para cuantificar los niveles de etanol en un embrión de pez cebra utilizando cromatografía de gases del espacio de la cabeza a partir de métodos de exposición adecuados para el procesamiento de embriones y el análisis de etanol.
Abstract
Los Trastornos del Espectro Alcohólico Fetal (TEAF) describen un continuo muy variable de defectos del desarrollo inducidos por etanol, incluyendo dismorfologías faciales y deficiencias neurológicas. Con una patología compleja, el TEAF afecta aproximadamente a 1 de cada 100 niños nacidos en los Estados Unidos cada año. Debido a la naturaleza altamente variable del FASD, los modelos animales han demostrado ser críticos en nuestra comprensión mecanicista actual de los defectos de desarrollo inducidos por etanol. Un número cada vez mayor de laboratorios se ha centrado en el uso de peces cebra para examinar defectos de desarrollo inducidos por etanol. Los peces cebra producen un gran número de embriones translúcidos, genéticamente traficados y fertilizados externamente. Esto permite a los investigadores controlar con precisión el tiempo y la dosis de la exposición al etanol en múltiples contextos genéticos y cuantificar el impacto de la exposición al etanol embrionario a través de técnicas de imagen en vivo. Esto, combinado con el alto grado de conservación tanto de la genética como del desarrollo con los seres humanos, ha demostrado que el pez cebra es un modelo potente en el que estudiar la base mecanicista de la teratogenicidad del etanol. Sin embargo, los regímenes de exposición al etanol han variado entre diferentes estudios de pez cebra, lo que ha confundido la interpretación de los datos del pez cebra a través de estos estudios. Este es un protocolo para cuantificar las concentraciones de etanol en embriones de pez cebra utilizando cromatografía de gases del espacio de la cabeza.
Introduction
Los Trastornos del Espectro Alcohólico Fetal (TEAF) describen una amplia gama de deficiencias neurológicas y dismorfologías craneofaciales asociadas con la exposición al etanol embrionario1. Múltiples factores, incluyendo el momento y la dosis de la exposición al etanol y los antecedentes genéticos, contribuyen a la variación del TEAF2,3. En los seres humanos, la compleja relación de estas variables hace que estudiar y entender la etiología del TEAF sea un reto. Los modelos animales han demostrado ser cruciales en el desarrollo de nuestra comprensión de la base mecanicista de la teratogenicidad del etanol. Se ha utilizado una amplia variedad de sistemas de modelos animales para estudiar múltiples aspectos del TEAF y los resultados han sido notablemente consistentes con lo que se encuentra en la exposición en humanos4. Los sistemas de modelos de roedores se utilizan para examinar muchos aspectos del FASD, siendo los ratones los5,6,7más comunes. La mayor parte de este trabajo se ha centrado en defectos de desarrollo a la exposición temprana al etanol8, aunque se ha demostrado que la exposición posterior al etanol causa anomalías en el desarrollo también9. Además, las capacidades genéticas de los ratones han ayudado en gran medida en nuestra capacidad de sondear los fundamentos genéticos del TEAF10,11. Estos estudios en ratones sugieren fuertemente que hay interacciones gene-etanol con la vía sónica de erizo, señalización de ácido retinoico, Superóxido dismutasa, óxido nítrico sintasa I, Aldh2 y Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Estos estudios muestran que los modelos animales son fundamentales para avanzar en nuestra comprensión del TEAF y sus mecanismos subyacentes.
El pez cebra ha surgido como un potente sistema modelo para examinar muchos aspectos de la teratogénesis del etanol22,23. Debido a su fertilización externa, alta fecundidad, capacidad genética de tractificación y capacidad de imagen en vivo, el pez cebra es ideal para estudiar factores como el momento, la dosificación y la genética de la teratogénesis del etanol. El etanol se puede administrar a embriones escenificados con precisión y los embriones pueden ser imágenados para examinar el impacto directo del etanol durante los procesos de desarrollo. Este trabajo puede estar relacionado directamente con los seres humanos, ya que los programas genéticos de desarrollo están altamente conservados entre los peces cebra y los seres humanos y, por lo tanto, pueden ayudar a guiar los estudios en humanos del TEAF24. Mientras que el pez cebra se ha utilizado para examinar la teratogénesis del etanol, la falta de consenso en la notificación de concentraciones de etanol embrionario hace que la comparación con los seres humanos sea difícil25. En los sistemas de mamíferos, los niveles de alcohol en sangre se correlacionan directamente con los niveles de etanol tisular26. Muchos de los estudios de pez cebra tratan embriones antes de la formación completa de su sistema circulatorio. Sin una muestra materna que examinar, se requiere un proceso para evaluar las concentraciones de etanol para cuantificar los niveles de etanol dentro del embrión. Aquí describimos un proceso para cuantificar las concentraciones de etanol en un embrión de pez cebra en desarrollo utilizando cromatografía de gases del espacio de la cabeza.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como sistema de modelo de desarrollo, el pez cebra es ideal para estudiar el impacto de los factores ambientales en el desarrollo. Producen un gran número de embriones fertilizados externamente, lo que permite paradigmas precisos de sincronización y dosificación en estudios de etanol. Esto, combinado con las capacidades de imagen en vivo y la conservación genética y del desarrollo con los seres humanos, hacen del pez cebra un poderoso sistema modelo para estudios de teratología. Descrito es un protocolo para medir …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación presentada en este artículo fue apoyada por subvenciones previas de los Institutos Nacionales de Salud/Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (NIH/NIDCR) R01DE020884 a J.K.E. y Institutos Nacionales de Salud/Instituto Nacional sobre Abuso de Alcohol y Alcoholismo (NIH/NIAAA) F32AA021320 a C.B.L. y por la subvención actual de los Institutos Nacionales de Salud/Instituto Nacional sobre Abuso de Alcohol (NIH/NIAAA) R00AA023560 a C.B.L. Agradecemos a Rueben Gonzales por proporcionar y ayudar con el análisis de cromatógrafo de gases. Agradecemos a Tiahna Ontiveros y a la Dra. Gina Nobles la asistencia para escribir.
Materials
| Air | Provided by contract to the university | ||
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| AutoSampler, CP-8400 | Varian | Gas Chromatograph Autosampler | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL | Agilent | 8010-0198 | Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa |
| Gas Chromatograph, CP-3800 | Varian | ||
| Helium | Provided by contract to the university | ||
| HP Innowax capillary column | Agilent | 19095N-123I | 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick |
| Hyrdogen | Provided by contract to the university | ||
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Fisher Scientific | 2682002 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap | Agilent | 5190-7021 | Replacement caps/septa for gas chromatograph vials |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pronase | VWR | 97062-916 | |
| Silica Beads .5 mm | Biospec Products | 11079105z | |
| Silica Beads 1.0 mm | Biospec Products | 11079110z | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane | Millipore Sigma | 57343-U | Replacement fibers |
| Star Chromatography Workstation | Varian | Chromatography software | |
| Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa | Millipore Sigma | 23154 | Replacement inlet septa |
References
- Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).
- Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).
- Williams, J. F., Smith, V. C. Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders. Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).
- Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice. International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).
- Marquardt, K., Brigman, J. L. The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models. Alcohol. 51, 1-15 (2016).
- Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).
- Lipinski, R. J., et al. Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent. PLoS One. 7 (8), 43067 (2012).
- Eberhart, J. K., Parnell, S. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).
- Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).
- Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).
- Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).
- Hong, M., Krauss, R. S. Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice. PLoSGenetics. 8 (10), 1002999 (2012).
- Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).
- Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome. The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).
- Wentzel, P., Eriksson, U. J. Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother. Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).
- Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).
- Bonthius, D. J., Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits. Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).
- Bonthius, D. J., et al. Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice. Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).
- Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).
- Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).
- Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).
- Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. Ethanol’s molecular targets. Science Signaling. 1 (28), (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , (1993).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
- Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio. Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).
- Lippi, G., et al. The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay. Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).
- Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID). Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).
- Heit, C., et al. Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).
- Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector. Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).
- Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection. Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).
- Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).
- Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain. Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).
- Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time. Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).
- Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).
- Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).
- Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).
