קוונפיקציה של רמות האתנול של עוברי דגים באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי
Summary
עבודה זו מתארת פרוטוקול לכמת רמות האתנול בעובר דג זברה באמצעות כרומטוגרפיה הראש שטח גז משיטות חשיפה נכונה לעיבוד העובר ניתוח אתנול.
Abstract
הפרעות בספקטרום האלכוהול העוברי (FASD) לתאר רצף משתנה מאוד של מומים התפתחותיים המושרה אתנול, כולל מורפולוגיות הפנים וליקויים נוירולוגיים. עם פתולוגיה מורכבת, FASD משפיע על כ 1 ב 100 ילדים שנולדו בארצות הברית בכל שנה. בשל האופי המשתנה מאוד של FASD, מודלים בעלי חיים הוכיחו ביקורתית הבנה המכונה הנוכחי שלנו של פגמים המושרה בפיתוח אתנול. מספר גדל והולך של מעבדות התמקד בשימוש בדגים כדי לבחון פגמים התפתחותיים המושרה אתנול. Zebrafish לייצר מספר גדול של הופרות חיצוני, מעוקב גנטית, עוברים שקופים. זה מאפשר לחוקרים לשלוט בדיוק בעיתוי והמינון של חשיפה אתנול בהקשרים גנטיים מרובים לכמת את ההשפעה של חשיפה האתנול עובריים באמצעות טכניקות הדמיה חיה. זה, בשילוב עם הרמה הגבוהה של שימור של גנטיקה ופיתוח עם בני אדם, הוכיחה הדגים להיות מודל רב עוצמה שבו ללמוד את הבסיס המכונה של הטרוגניות האתנול. עם זאת, חשיפה האתנול משטרי יש מגוון בין מחקרים שונים דג זברה, אשר יש לבולבל את הפרשנות של נתוני דג זברה על פני מחקרים אלה. הנה פרוטוקול כדי כמת ריכוזי האתנול בעוברי דג דג זברה באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי.
Introduction
הפרעות בספקטרום האלכוהול העוברי (FASD) מתאר מגוון רחב של ליקויי נוירולוגיות ו הגולגולת דיסקוורפולוגיות הקשורים לחשיפה האתנול העובריים1. גורמים מרובים, כולל עיתוי ומינון של חשיפה אתנול ורקע גנטי, לתרום וריאציה של fasd2,3. בבני אדם, מערכת היחסים המורכבת של משתנים אלה עושה לימוד והבנה של האטיולוגיה של FASD מאתגרת. דגמי בעלי חיים הוכיחו באופן קריטי בפיתוח ההבנה שלנו לגבי הבסיס המכניסטי של האתנול הטרוגניות. מגוון רחב של מערכות מודל בעלי חיים נעשה שימוש כדי ללמוד היבטים מרובים של FASD ותוצאות היו עקביים במידה ניכרת עם מה נמצא בחשיפה בבני אדם4. מערכות דגם מכרסמים משמשים כדי לבחון היבטים רבים של fasd, עם עכברים להיות הנפוצים ביותר5,6,7. רוב העבודה התמקדה פגמים התפתחותיים לחשיפה מוקדמת של אתנול8, למרות מאוחר יותר חשיפה לאתנול הוכח לגרום לחריגות התפתחותיות כמו גם9. יתר על כן, היכולות הגנטיות של עכברים סייעו מאוד היכולת שלנו לחקור את בסיס גנטי של fasd10,11. מחקרים אלה בעכברים מצביעים מאוד על כך יש אינטראקציות ג’ין אתנול עם מסלול קיפוד סוניק, חומצה retinoic איתות, סופראוקסיד dismutase תחמוצת חנקן סטנדרטים I, Aldh2 ו Fancd28,10,11,12,13,14,15,16, 17, 18, 5, 19,19,19, 19,20,21. מחקרים אלה מראים כי מודלים בעלי חיים הם קריטיים כדי לקדם את ההבנה שלנו של FASD ואת המנגנונים הבסיסיים שלה.
דג דג זברה התפתחה כמערכת דגם רב עוצמה כדי לבחון היבטים רבים של אתנול teratogenesis22,23. בשל ההפריה החיצונית שלהם, פוריות גבוהה, מעקב גנטי, ויכולות הדמיה חיה, מתאימים באופן אידיאלי לגורמי לימוד כגון עיתוי, מינון, וגנטיקה של האתנול teratogenesis. האתנול יכול להינתן לעוברים מבויים בדיוק והעוברים יכולים להיות בתמונה כדי לבחון את ההשפעה הישירה של אתנול במהלך תהליכים התפתחותיים. עבודה זו יכולה להיות קשורה ישירות לבני אדם, כי התוכניות הגנטיות של הפיתוח הם שימור מאוד בין דג ובני אדם ולכן יכול לעזור להנחות FASD מחקרים אנושיים24. בעוד דגים שימשו כדי לבחון את האתנול teratogenesis, חוסר הסכמה בדיווח ריכוזי אתנול עובריים עושה השוואה לבני אדם קשה25. במערכות היונקים, רמות אלכוהול בדם מתאם ישירות לרמות האתנול של רקמות26. רבים ממחקרי הדגים מתייחסים לעוברים לפני היווצרות מוחלט של מערכת הדם שלהם. ללא מדגם אימהי לבחון, תהליך להערכת ריכוזי אתנול נדרש כדי לכמת את רמות האתנול בתוך העובר. כאן אנו מתארים תהליך לכמת ריכוזי אתנול בתוך העובר בפיתוח דג זברה באמצעות כרומטוגרפיה גז שטח הראש.
Protocol
Representative Results
Discussion
כמערכת מודל התפתחותית, הדגים מתאימים באופן אידיאלי לחקר ההשפעה של גורמים סביבתיים בפיתוח. הם מייצרים מספר גדול של עוברים מופרות חיצוני, אשר מאפשר תזמון מדויק ומינון בלימודי אתנול. זה, בשילוב עם יכולות הדמיה חיה ושימור גנטי והתפתחותי עם בני אדם, להפוך את הדגים מערכת מודל רבת עוצמה ללימודי ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר המוצג במאמר זה היה נתמך על ידי מענקים קודמים מן המכונים הלאומיים לבריאות/המכון הלאומי לרפואת שיניים ומחקר הגולגולת (NIH/נדבך) R01DE020884 ל J.K.E. והמכון הלאומי לבריאות/המכון הלאומי על אלכוהול התעללות ואלכוהוליזם (NIH/NIAAA) F32AA021320 כדי C.B.L. ועל ידי המענק הנוכחי מן המוסדות הלאומיים לבריאות/המכון הלאומי על אלכוהול התעללות (NIH/NIAAA) R00AA023560 כדי C.B.L. אנו מודים לרואבן גונזלס למתן ולסייע בניתוח כרומוטוגרף גז. אנחנו מודים לטיטנה בונטיקוס. וד ר ג’ינה נובלס כותבים עזרה
Materials
| Air | Provided by contract to the university | ||
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| AutoSampler, CP-8400 | Varian | Gas Chromatograph Autosampler | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL | Agilent | 8010-0198 | Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa |
| Gas Chromatograph, CP-3800 | Varian | ||
| Helium | Provided by contract to the university | ||
| HP Innowax capillary column | Agilent | 19095N-123I | 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick |
| Hyrdogen | Provided by contract to the university | ||
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Fisher Scientific | 2682002 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap | Agilent | 5190-7021 | Replacement caps/septa for gas chromatograph vials |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pronase | VWR | 97062-916 | |
| Silica Beads .5 mm | Biospec Products | 11079105z | |
| Silica Beads 1.0 mm | Biospec Products | 11079110z | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane | Millipore Sigma | 57343-U | Replacement fibers |
| Star Chromatography Workstation | Varian | Chromatography software | |
| Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa | Millipore Sigma | 23154 | Replacement inlet septa |
References
- Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).
- Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).
- Williams, J. F., Smith, V. C. Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders. Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).
- Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice. International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).
- Marquardt, K., Brigman, J. L. The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models. Alcohol. 51, 1-15 (2016).
- Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).
- Lipinski, R. J., et al. Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent. PLoS One. 7 (8), 43067 (2012).
- Eberhart, J. K., Parnell, S. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).
- Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).
- Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).
- Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).
- Hong, M., Krauss, R. S. Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice. PLoSGenetics. 8 (10), 1002999 (2012).
- Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).
- Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome. The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).
- Wentzel, P., Eriksson, U. J. Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother. Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).
- Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).
- Bonthius, D. J., Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits. Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).
- Bonthius, D. J., et al. Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice. Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).
- Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).
- Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).
- Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).
- Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. Ethanol’s molecular targets. Science Signaling. 1 (28), (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , (1993).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
- Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio. Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).
- Lippi, G., et al. The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay. Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).
- Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID). Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).
- Heit, C., et al. Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).
- Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector. Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).
- Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection. Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).
- Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).
- Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain. Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).
- Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time. Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).
- Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).
- Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).
- Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).
