Quantificare le dimensioni del fegato nel pesce zebra Larval utilizzando la microscopia Brightfield
Summary
Qui dimostriamo un metodo per quantificare le dimensioni del fegato nel pesce zebra larvale, fornendo un modo per valutare gli effetti delle manipolazioni genetiche e farmacologiche sulla crescita e lo sviluppo del fegato.
Abstract
In diversi modelli transgenici di pesce zebra del carcinoma epatocellulare (HCC), l’epatomegalia può essere osservata durante le fasi precoci della larva. Quantificare le dimensioni del fegato larvale nei modelli HCC del pesce zebra fornisce un mezzo per valutare rapidamente gli effetti dei farmaci e di altre manipolazioni su un fenotipo relativo all’oncogene. Qui mostriamo come riparare le larve di pesce zebra, sezionare i tessuti che circondano il fegato, fotografare i fegati usando la microscopia a campo luminoso, misurare l’area del fegato e analizzare i risultati. Questo protocollo consente una quantificazione rapida e precisa delle dimensioni del fegato. Poiché questo metodo comporta la misurazione dell’area del fegato, può sottovalutare le differenze nel volume del fegato e sono necessarie metodologie complementari per distinguere tra i cambiamenti nelle dimensioni delle cellule e i cambiamenti nel numero di cellule. La tecnica di dissezione qui descritta è un ottimo strumento per visualizzare il fegato, l’intestino e il pancreas nelle loro posizioni naturali per una miriade di applicazioni a valle, tra cui la colorazione immunofluorescenza e l’ibridazione in situ. La strategia descritta per la quantificazione delle dimensioni del fegato larvale è applicabile a molti aspetti dello sviluppo e della rigenerazione epatica.
Introduction
Il carcinoma epatocellulare (HCC) è la malignità primaria più comune del fegato1 e la terza causa principale di mortalità correlata al cancro2. Per comprendere meglio i meccanismi dell’epatocarcinogenesi e identificare potenziali terapie HCC, noi e altri abbiamo sviluppato pesci zebra transgenici in cui l’espressione specifica dell’epatocite di oncogeni come3,4, Kras (V12)5,6, Myc7o Yap18 porta all’HCC negli animali adulti. In questi pesci zebra, l’allargamento del fegato è notato già 6 giorni dopo la fecondazione (dpf), fornendo una piattaforma facile per testare gli effetti dei farmaci e alterazioni genetiche sulla crescita eccessiva del fegato guidato dall’oncogene. Una misurazione accurata e precisa delle dimensioni del fegato larvale è essenziale per determinare gli effetti di queste manipolazioni.
Le dimensioni e la forma del fegato possono essere valutate in modo semi-quantitativo nelle larve fisse di pesce zebra da CY3-SA etichettatura9 o in larve di pesce zebra dal vivo utilizzando giornalisti fluorescenti epatociti specifici e microscopia sesicazione fluorescenza5,6. Quest’ultimo metodo è relativamente veloce, e la sua mancanza di precisione può essere affrontata fotografando e misurando l’area di ogni fegato utilizzando il software di elaborazione delle immagini7,10. Tuttavia, può essere tecnicamente difficile posizionare uniformemente tutte le larve vive in un esperimento tale che l’area epatica bidimensionale è una rappresentazione accurata delle dimensioni del fegato. Una tecnica simile per la quantificazione delle dimensioni del fegato prevede l’utilizzo della microscopia a fluorescenza leggera per quantificare il volume epatico larvale8, che può essere più accurata per rilevare le differenze di dimensioni quando il fegato viene espanso in modo non uniforme in diverse dimensioni. Lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) può essere utilizzato per contare il numero di epatociti fluorescenti e altri tipi di cellule epatiche nei fegati larve8,11. In questo metodo, i fegati larghi sono raggruppati e dissociati, quindi le informazioni sulle dimensioni e la forma del singolo fegato vengono perse. In combinazione con un altro metodo di determinazione delle dimensioni del fegato, FACS consente la differenziazione tra aumento del numero di cellule (iperplasia) e aumento delle dimensioni della cellula (ipertrofia). Tutti questi metodi impiegano una costosa tecnologia a fluorescenza (microscopio o selezionatrice cellulare) e, fatta eccezione per l’etichettatura CY3-SA, richiedono l’etichettatura degli epatociti con un reporter fluorescente.
Qui descriviamo in dettaglio un metodo per quantificare l’area del fegato larvale del pesce zebra utilizzando la microscopia a campo luminoso e il software di elaborazione delle immagini3,12,13,14. Questo protocollo consente una quantificazione precisa dell’area dei singoli fegati in situ senza l’uso della microscopia a fluorescenza. Durante l’analisi delle dimensioni del fegato, accechiamo l’identità dell’immagine per ridurre la distorsione degli sperimentatori e migliorare il rigore scientifico15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quantificazione della dimensione del fegato è cruciale negli studi volti a comprendere lo sviluppo del fegato, rigenerazione, e oncogenesi. Il protocollo qui descritto è una tecnica relativamente rapida, facile ed economica per la quantificazione delle dimensioni del fegato nel pesce zebra larvale. L’esercizio di un’adeguata cautela durante l’esecuzione di determinati aspetti del protocollo può aiutare a migliorare la precisione dei risultati e a ridurre la frustrazione.
Una corretta fissaz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo riconoscere Maurine Hobbs e la Centralit zebrefish Animal Resource dell’Università dello Utah per aver fornito allevamento di pesci zebra, spazi di laboratorio e attrezzature per svolgere porzioni di questa ricerca. L’espansione del cSAR è supportata in parte dalla sovvenzione NIH – 1G20OD018369-01. Ringraziamo anche Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum e il Huntsman Cancer Institute (HCI) zebrefish Facility per la cura del pesce zebra. Vorremmo ringraziare Kenneth Kompass per l’aiuto con la programmazione R. Questo lavoro è stato finanziato in parte dalle sovvenzioni della Huntsman Cancer Foundation (in collaborazione con la sovvenzione P30 CA042014 assegnata al Huntsman Cancer Institute) (KJE) e NIH/NCI R01CA222570 (KJE).
Materials
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
- Lin, D. -. C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
- Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).
- Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
- Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
- Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
- Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
- Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
- Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
- Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), 21-28 (2012).
- Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42 (2015).
- Kim, S. -. H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
- Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).
- Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), 1339-1348 (2011).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
