Brightfield Mikroskobu Kullanan Larva Zebrabalığında Karaciğer Boyutunun Ölçülmesi
Summary
Burada larva zebra balığında karaciğer boyutunu ölçmek için bir yöntem göstermek, karaciğer büyümesi ve gelişimi üzerinde genetik ve farmakolojik manipülasyonetkilerini değerlendirmek için bir yol sağlar.
Abstract
Hepatosellüler karsinom (HCC) çeşitli transgenik zebra balığı modellerinde erken larva evrelerinde hepatomegali görülebilir. Zebrabalığı HCC modellerinde larva karaciğer boyutunun ölçülmesi, ilaçların ve diğer manipülasyonların onkogene bağlı fenotip üzerindeki etkilerini hızla değerlendirmek için bir araç sağlar. Burada zebra balığı larvalarının nasıl düzeltilebildiğini, karaciğeri çevreleyen dokuları nasıl inceleyeceğimi, parlak alan mikroskobu kullanarak karaciğerleri nasıl fotoğraflayabildiğimizi, karaciğer bölgesini nasıl ölçtüğünü ve sonuçları analiz edebileceğimizi gösteriyoruz. Bu protokol karaciğer boyutunun hızlı ve hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar. Bu yöntem karaciğer alanının ölçülmesini içerdiğinden, karaciğer hacmindeki farklılıkları hafife alabilir ve hücre büyüklüğündeki değişimler ile hücre sayısındaki değişimleri ayırt etmek için tamamlayıcı metodolojiler gereklidir. Burada açıklanan diseksiyon tekniği, immünoresans boyama ve yerinde hibridizasyon dahil olmak üzere sayısız downstream uygulamaları için doğal konumlarında karaciğer, bağırsak ve pankreas görselleştirmek için mükemmel bir araçtır. Larva karaciğer boyutunu ölçmek için açıklanan strateji karaciğer gelişimi ve rejenerasyon birçok yönü için geçerlidir.
Introduction
Hepatosellüler karsinom (HCC) karaciğerin en sık görülen primer malignitesi1 ve kansere bağlı mortalitenin üçüncü önde gelennedenidir 2. Hepatokarsinogenezin mekanizmalarını daha iyi anlamak ve potansiyel HCC terapötiklerini belirlemek için, biz ve diğerleri β-catenin3,4,Kras(V12)5,6, Myc7, Yap18 gibi onkogenlerin hepatosite özgü ekspresyonu olan transgenik zebra balığı geliştirdik. Bu zebra balıklarında, karaciğer genişlemesi kadar erken olarak not edilir 6 gün sonrası döllenme (dpf), onkogen güdümlü karaciğer büyümesi üzerinde ilaçların ve genetik değişikliklerin etkilerini test etmek için kolay bir platform sağlayan. Larva karaciğer boyutunun doğru ve kesin ölçümü bu manipülasyonların etkilerini belirlemek için gereklidir.
Karaciğer büyüklüğü ve şekli, sabit zebrabalığı larvalarında 9 veya canlı zebrabalığı larvalarında hepatosite özgü floresan muhabirler ve floresan diseksiyon mikroskopisi kullanılarak yarı kantitatif olarak değerlendirilebilir5,6. İkinci yöntem nispeten hızlı, ve hassasiyet eksikliği fotoğraflama ve görüntü işlemeyazılımı7 kullanarak her karaciğer alanı ölçümü ile ele alınabilir 7,10. Ancak, teknik olarak iki boyutlu karaciğer alanı karaciğer boyutunun doğru bir temsili olduğunu bir deney de tüm canlı larvaları eşit konumlandırmak zor olabilir. Karaciğer boyutunu ölçmek için benzer bir teknik larva karaciğer hacmi ölçmek için hafif levha floresan mikroskopi kullanarak içerir8, karaciğer farklı boyutlarda düzgün olmayan genişletildiğinde boyut farklılıkları tespit etmek için daha doğru olabilir. Floresan aktive hücre sıralama (FACS) larva karaciğerlerinde floresan hepatosit ler ve diğer karaciğer hücre tipleri8,11etiketli sayısını saymak için kullanılabilir . Bu yöntemde, larva karaciğerleri havuza alınır ve ayrıştırılır, böylece bireysel karaciğer büyüklüğü ve şekli hakkında bilgi kaybolur. Başka bir karaciğer boyutu belirleme yöntemi ile birlikte, FACS artan hücre numarası (hiperplazi) ve artan hücre büyüklüğü (hipertrofi) arasında ayrım sağlar. Tüm bu yöntemler pahalı floresan teknolojisi (mikroskop veya hücre ayırıcı) kullanır ve CY3-SA etiketleme dışında, bir floresan muhabiri ile hepatosit etiketleme gerektirir.
Burada ayrıntılı olarak parlak alan mikroskobu ve görüntü işleme yazılımı3,12,13,14kullanarak zebra balığı larva karaciğer alanı ölçmek için bir yöntem açıklar. Bu protokol floresan mikroskopisi kullanılmadan bireysel karaciğerlerin yerinde tam olarak sayısallaştırılmasını sağlar. Karaciğer boyutunu analiz ederken, biz araştırmacı önyargı azaltmak ve bilimsel titizlik geliştirmek için görüntü kimliğini kör15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Karaciğer gelişimini, rejenerasyonu ve onkogenezini anlamaya yönelik çalışmalarda karaciğer büyüklüğünün sayısallaştırılması çok önemlidir. Burada açıklanan protokol larva zebra balığında karaciğer büyüklüğü niceliği için nispeten hızlı, kolay ve ucuz bir tekniktir. Protokolün belirli yönlerini uygularken uygun dikkatli olunması, sonuçların doğruluğunun artmasına ve hayal kırıklığının azalmasına yardımcı olabilir.
Larvaların doğru fiksasyon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Maurine Hobbs ve Merkezi Zebrafish Hayvan Kaynağı (CZAR) Utah Üniversitesi’nde zebrabalığı yetiştiriciliği, laboratuvar alanı ve ekipman bu araştırmanın bölümlerini yürütmek için sağlamak için kabul etmek istiyorum. CZAR genişlemesi kısmen NIH hibe # 1G20OD018369-01 tarafından desteklenir. Biz de Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum ve Huntsman Kanser Enstitüsü (HCI) Zebrabalığı Tesisi zebra balığı bakımı için teşekkür etmek istiyorum. Biz R programlama ile ilgili yardım için Kenneth Kompass teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma kısmen Huntsman Kanser Vakfı’nın (P30 CA042014’ün Huntsman Kanser Enstitüsü’ne verilen hibe ile birlikte) ve NIH/NCI R01CA2222570 (KJE) hibeleri ile finanse edilmiştir.
Materials
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
- Lin, D. -. C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
- Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).
- Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
- Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
- Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
- Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
- Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
- Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
- Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), 21-28 (2012).
- Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42 (2015).
- Kim, S. -. H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
- Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).
- Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), 1339-1348 (2011).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
