Cuantificación del tamaño del hígado en el pez cebra larvario mediante la microscopía Brightfield
Summary
Aquí demostramos un método para cuantificar el tamaño del hígado en el pez cebra larval, proporcionando una manera de evaluar los efectos de las manipulaciones genéticas y farmacológicas en el crecimiento y desarrollo del hígado.
Abstract
En varios modelos transgénicos de peces cebra de carcinoma hepatocelular (HCC), se puede observar hepatomegalia durante las primeras etapas larvales. La cuantificación del tamaño del hígado larvario en los modelos de HCC de pez cebra proporciona un medio para evaluar rápidamente los efectos de los fármacos y otras manipulaciones en un fenotipo relacionado con oncogén. Aquí mostramos cómo reparar larvas de peces cebra, diseccionar los tejidos que rodean el hígado, fotografiar hígados usando microscopía de campo brillante, medir el área hepática y analizar los resultados. Este protocolo permite una cuantificación rápida y precisa del tamaño del hígado. Como este método implica medir el área hepática, puede subestimar las diferencias en el volumen hepático, y se requieren metodologías complementarias para diferenciar entre los cambios en el tamaño celular y los cambios en el número de células. La técnica de disección descrita en este documento es una excelente herramienta para visualizar el hígado, el intestino y el páncreas en sus posiciones naturales para innumerables aplicaciones aguas abajo, incluyendo la tinción de inmunofluorescencia y la hibridación in situ. La estrategia descrita para cuantificar el tamaño del hígado larvario es aplicable a muchos aspectos del desarrollo y la regeneración del hígado.
Introduction
El carcinoma hepatocelular (HCC) es la neoplasia maligna primaria más común del hígado1 y la tercera causa de mortalidad relacionada con el cáncer2. Para comprender mejor los mecanismos de la hepatocarcinogénesis e identificar posibles terapias de HCC, nosotros y otros hemos desarrollado peces cebra transgénicos en los que la expresión específica de hepatocitos de oncogenes tales como la -catenina3,4, Kras(V12)5,6, Myc7, o Yap18 conduce a HCC en animales adultos. En estos peces cebra, el agrandamiento del hígado se observa ya 6 días después de la fertilización (dpf), proporcionando una plataforma fácil para probar los efectos de los fármacos y alteraciones genéticas en el crecimiento excesivo del hígado impulsado por oncógeno. La medición precisa y precisa del tamaño del hígado larvaria es esencial para determinar los efectos de estas manipulaciones.
El tamaño y la forma del hígado pueden evaluarse semicuantitativamente en larvas fijas de peces cebra etiquetando CY3-SA9 o en larvas de peces cebra vivos utilizando reporteros fluorescentes específicos de hepatoparcitos y microscopía de disección de fluorescencia5,6. Este último método es relativamente rápido, y su falta de precisión se puede abordar fotografiando y midiendo el área de cada hígado utilizando el software de procesamiento de imágenes7,10. Sin embargo, puede ser técnicamente difícil posicionar uniformemente todas las larvas vivas en un experimento tal que el área hepática bidimensional es una representación precisa del tamaño del hígado. Una técnica similar para cuantificar el tamaño del hígado implica el uso de microscopía de fluorescencia de láminas de luz para cuantificar el volumen del hígado larvario8, que puede ser más precisa para detectar diferencias de tamaño cuando el hígado se expande de forma no uniforme en diferentes dimensiones. La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) se puede utilizar para contar el número de hepatocitos etiquetados fluorescentemente y otros tipos de células hepáticas en hígados larvarios8,11. En este método, los hígados larvales se agrupan y se disocian, por lo que se pierde información sobre el tamaño y la forma del hígado individual. En combinación con otro método de determinación del tamaño del hígado, FACS permite la diferenciación entre el aumento del número de células (hiperplasia) y el aumento del tamaño celular (hipertrofia). Todos estos métodos emplean costosa tecnología de fluorescencia (microscopio o clasificador celular) y, a excepción del etiquetado CY3-SA, requieren el etiquetado de hepatocitos con un reportero fluorescente.
Aquí describimos en detalle un método para cuantificar el área del hígado larvario de peces cebra utilizando microscopía de campo brillante y software de procesamiento de imágenes3,12,13,14. Este protocolo permite cuantificar con precisión el área de hígados individuales in situ sin el uso de microscopía de fluorescencia. Al analizar el tamaño del hígado, cegamos la identidad de la imagen para reducir el sesgo del investigador y mejorar el rigor científico15.
Protocol
Representative Results
Discussion
La cuantificación del tamaño del hígado es crucial en estudios dirigidos a comprender el desarrollo hepático, regeneración y oncogénesis. El protocolo descrito aquí es una técnica relativamente rápida, fácil y barata para la cuantificación del tamaño del hígado en peces cebra larvaria. Ejercer la precaución apropiada mientras se realizan ciertos aspectos del protocolo puede ayudar a aumentar la precisión de los resultados y disminuir la frustración.
La fijación adecuada de las…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría reconocer a Maurine Hobbs y el Centrald Zebrafish Animal Resource (CZAR) en la Universidad de Utah por proporcionar cría de peces cebra, espacio de laboratorio y equipo para llevar a cabo porciones de esta investigación. La expansión del CZAR es apoyada en parte por la subvención NIH n.o 1G20OD018369-01. También nos gustaría dar las gracias a Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum, y la instalación de pez cebra del Huntsman Cancer Institute (HCI) para el cuidado del pez cebra. Nos gustaría agradecer a Kenneth Kompass por su ayuda con la programación R. Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones de la Fundación Huntsman Cancer (en conjunto con la subvención P30 CA042014 otorgada al Huntsman Cancer Institute) (KJE) y NIH/NCI R01CA222570 (KJE).
Materials
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
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