تحديد حجم الكبد في لارفال زيبرافيش باستخدام المجهر برايتفيلد
Summary
هنا نبين طريقة لقياس حجم الكبد في سمك الحمار الوحشي اليرقان، وتوفير وسيلة لتقييم آثار التلاعب الجيني والدوائي على نمو الكبد والتنمية.
Abstract
في العديد من نماذج حمار وحشي معدلة وراثيا من سرطان الكبد الخلوي (HCC)، يمكن ملاحظة الأوميغا الكبدي خلال المراحل اليرقات المبكرة. يوفر تحديد حجم الكبد اليرقات يُقدم في نماذج HCC لسمك الحمار الوحشي وسيلة لتقييم آثار الأدوية وغيرها من التلاعبات على النمط الظاهري المرتبط بالأوكوجين بسرعة. هنا نعرض كيفية إصلاح يرقات سمك الحمار الوحشي ، وتشريح الأنسجة المحيطة بالكبد ، وتصوير الكبد باستخدام المجهر المشرق ، وقياس منطقة الكبد ، وتحليل النتائج. يتيح هذا البروتوكول قياسًا دقيقًا وسريعًا لحجم الكبد. وبما أن هذه الطريقة تنطوي على قياس منطقة الكبد، فقد تقلل من شأن الاختلافات في حجم الكبد، ويلزم منهجيات تكميلية للتمييز بين التغيرات في حجم الخلية والتغيرات في عدد الخلايا. تقنية تشريح وصفها هنا هو أداة ممتازة لتصور الكبد, الأمعاء, والبنكرياس في مواقعها الطبيعية لتطبيقات المصب لا تعد ولا تحصى بما في ذلك تلطيخ الفلورالمناعي والتهجين في الموقع. الاستراتيجية الموصوفة لقياس حجم الكبد اليرقات ينطبق على العديد من جوانب تطوير الكبد والتجدد.
Introduction
سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو الخبيثة الأولية الأكثر شيوعا من الكبد1 والسبب الرئيسي الثالث للوفيات المرتبطة بالسرطان2. من أجل فهم أفضل لآليات الخلايا الكبدية وتحديد العلاجات HCC المحتملة، ونحن والآخرين قد وضعت حمار وحشي المعدلة وراثيا التي التعبير عن خلايا الكبد محددة من الأورام مثل α-catenin3،4،كراس (V12)5،6،Myc7،أو Yap18 يؤدي إلى HCC في الحيوانات البالغة. في هذه الحمار الوحشي، ويلاحظ تضخم الكبد في وقت مبكر من 6 أيام بعد الإخصاب (dpf)، وتوفير منصة سهلة لاختبار آثار الأدوية والتعديلات الوراثية على نمو الكبد التي يحركها الأوجين. القياس الدقيق والدقيق لحجم الكبد اليرقات ضروري لتحديد آثار هذه التلاعبات.
يمكن تقييم حجم الكبد وشكله شبه الكمي في يرقات حمار وحشي ثابتة من قبل CY3-SA وضع العلامات9 أو في يرقات حمار وحشي حية باستخدام مراسلين فلورسنت خاصين بالكبد وفلورسينس تشريح المجهر5،6. الطريقة الأخيرة سريعة نسبيا، ويمكن معالجة افتقارها إلى الدقة عن طريق تصوير وقياس مساحة كل كبد باستخدام برنامج معالجة الصور7،10. ومع ذلك ، يمكن أن يكون من الصعب تقنيًا وضع جميع اليرقات الحية بشكل موحد في تجربة بحيث تكون منطقة الكبد ثنائية الأبعاد تمثيلًا دقيقًا لحجم الكبد. تقنية مماثلة لقياس حجم الكبد ينطوي على استخدام المجهر ضوء ورقة مضان لتحديد حجم الكبد اليرقات8، والتي قد تكون أكثر دقة للكشف عن اختلافات الحجم عندما يتم توسيع الكبد غير موحد ة في أبعاد مختلفة. يمكن استخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS) لحساب عدد خلايا الكبد المسماة بالفلور سنتسنت وأنواع خلايا الكبد الأخرى في الكبد اليرقات8،11. في هذه الطريقة ، يتم تجميع الكبد اليرقات وفصلها ، لذلك يتم فقدان المعلومات حول حجم الكبد الفردي وشكله. في تركيبة مع طريقة أخرى لتحديد حجم الكبد، يتيح FACS التمايز بين زيادة عدد الخلايا (تضخم) وزيادة حجم الخلية (تضخم). كل هذه الأساليب تستخدم تكنولوجيا الفلورسينس مكلفة (المجهر أو فرز الخلايا) ، وباستثناء وضع العلامات CY3-SA ، تتطلب وضع علامات على خلايا الكبد مع مراسل الفلورسنت.
هنا نصف بالتفصيل طريقة لتحديد كمية حمار وحشي منطقة الكبد اليرقة باستخدام المجهر مشرق المجال ومعالجة الصور البرمجيات3،12،13،14. يتيح هذا البروتوكول التحديد الكمي الدقيق لمنطقة الكبد الفردية في الموقع دون استخدام المجهر الفلوري. أثناء تحليل حجم الكبد ، فإننا نعمي هوية الصورة للحد من تحيز المحقق وتحسين الصرامة العلمية15.
Protocol
Representative Results
Discussion
القياس الكمي لحجم الكبد أمر بالغ الأهمية في الدراسات التي تهدف إلى فهم نمو الكبد، والتجدد، والأورام. البروتوكول الموصوف هنا هو تقنية سريعة نسبيا وسهلة ورخيصة لحجم الكبد في كمية حمار وحشي اليرقات. يمكن أن تساعد ممارسة الحذر المناسب أثناء تنفيذ جوانب معينة من البروتوكول في زيادة دقة النتائ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعترف تورين هوبز والموارد الحيوانية حمار وحشي مركزي (CZAR) في جامعة يوتا لتوفير تربية حمار وحشي، والفضاء المختبري، والمعدات اللازمة لتنفيذ أجزاء من هذا البحث. ويدعم التوسع في CZAR جزئيا من قبل منحة المعاهد القومية للصحة # 1G20OD018369-01. ونود أيضا أن نشكر رودني ستيوارت، كلوي ليم، لانس غراهام، كودي جيمس، غاريت نكوم، ومعهد هانتسمان للسرطان (HCI) مرفق حمار وحشي لرعاية حمار وحشي. نود أن نشكر كينيث كومباس للمساعدة في البرمجة R. تم تمويل هذا العمل جزئيا ً من خلال منح من مؤسسة هانتسمان للسرطان (بالتزامن مع المنحة P30 CA042014 الممنوحة لمعهد هانتسمان للسرطان) (KJE) وNIH/NCI R01CA222570 (KJE).
Materials
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
- Lin, D. -. C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
- Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).
- Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
- Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
- Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
- Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
- Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
- Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
- Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), 21-28 (2012).
- Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42 (2015).
- Kim, S. -. H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
- Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).
- Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), 1339-1348 (2011).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
