בדיקת גודל הכבד בזחל זברה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד
Summary
כאן אנו להפגין שיטה לכמת את גודל הכבד בזחל zebrafish, מתן דרך להעריך את ההשפעות של מניפולציות גנטיות ופרמקולוגית על גידול בכבד ופיתוח.
Abstract
בכמה מודלים הטרנסגניים של דגי hepatocellular (HCC), hepatomegaly ניתן לצפות במהלך שלבי הזחל המוקדמים. בדיקת גודל הזחל הכבד ב דג זברה מודלים HCC מספק אמצעים כדי להעריך במהירות את ההשפעות של תרופות ומניפולציות אחרות על פניטיפים הקשורים אונאוגן. כאן אנו מראים כיצד לתקן הזחלים דג זברה, לנתח את הרקמות סביב הכבד, צילום כבדים באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר, למדוד את אזור הכבד, ולנתח את התוצאות. פרוטוקול זה מאפשר כימות מהירה ומדויקת של גודל הכבד. כאשר שיטה זו כרוכה במדידת אזור הכבד, הוא עשוי להמעיט בערכם של עוצמת הכבד, ומתודולוגיות משלימות נדרשות כדי להבדיל בין שינויים בגודל התא ושינויים במספר התאים. טכניקת החיתוך המתוארת בזאת היא כלי מצוין להמחיש את הכבד, הבטן והלבלב בעמדותיהם הטבעיות לצורך מספר יישומים בזרם המים, כולל כתמים immunofluorescence והיברידיזציה באתרו. האסטרטגיה המתוארת עבור כימות הכבד הזחל היא ישימה היבטים רבים של התפתחות הכבד והתחדשות.
Introduction
קרצינומה hepatocellular (HCC) הוא הגורם העיקרי הנפוץ ביותר של הכבד1 ואת הסיבה המובילה השלישית לתמותה הקשורות לסרטן2. כדי להבין טוב יותר מנגנונים של hepatocarcinogenesis ולזהות HCC therapeutics פוטנציאלי, אנחנו ואחרים פיתחנו בעלי החיים הטרנסגניים שבהם הביטוי הספציפי hepatציט של אונגנס כגון β-catenin3,4, קראס (רובוטית v12)5,6, myc7, או Yap18 מוביל HCC בבעלי חיים למבוגרים. ב זה zebrafish, הגדלת הכבד הוא ציין מוקדם ככל 6 ימים הפריה הפוסט (dpf), מתן פלטפורמת נתיישב לבדיקת ההשפעות של תרופות ושינויים גנטיים על הצמיחה אונגן מונחה הכבד. מדידה מדויקת ומדויקת של גודל בכבד זחל חיוני לקביעת ההשפעות של המניפולציות האלה.
גודל הכבד והצורה ניתן להעריך חצי-כימות הזחלים של דג זברה קבוע על ידי CY3-SA תיוג9 או ב חיים דג זברה הזחלים באמצעות hepatocyte-כתבים פלורסנט ספציפיים הניתוח מיקרוסקופ5,6. השיטה האחרונה היא מהירה יחסית, והיעדר דיוק שלה ניתן לטפל על ידי צילום ומדידת האזור של כל כבד באמצעות תוכנה עיבוד תמונה7,10. עם זאת, זה יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית מיקום אחיד כל הזחלים לחיות בניסוי כזה שאזור כבד דו מימדי הוא ייצוג מדויק של גודל הכבד. טכניקה דומה לכמת את גודל הכבד כוללת שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית אור לכמת את עוצמת הזחל הכבד8, אשר עשוי להיות מדויק יותר לזיהוי הבדלים בגודל כאשר הכבד מורחב לא אחיד בממדים שונים. מיון תא מופעל על-ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS) יכול לשמש כדי לספור את מספר החומרים המסומנים fluorescently וסוגים אחרים של תאי הכבד בזחל כבדים8,11. בשיטה זו, כבדי זחל הם במאגר והנתק, כך מידע על גודל הכבד בודדים וצורה הוא איבד. בשילוב עם שיטת קביעת גודל כבד אחרת, FACS מאפשר הבדלה בין מספר התאים המוגבר (היפרפלזיה) וגודל התא גדל (היפרפרס). כל השיטות הללו מעסיקים טכנולוגיה פלואורסצנטית יקרה (מיקרוסקופ או סדרן תאים) ו, למעט תיוג CY3-SA, דורשים תיוג של hepatocytes עם כתב פלורסנט.
כאן אנו מתארים בפרוטרוט שיטה לכמת את השטח של הזחל הכבד באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר ותוכנה עיבוד תמונה3,12,13,14. פרוטוקול זה מאפשר כימות מדויקות של אזור הכבדים הבודדים באתרו ללא שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. במהלך ניתוח גודל הכבד, אנו מעוורים את זהות התמונה כדי להפחית את הטיית החוקר ולשפר את הקשיחות המדעית15.
Protocol
Representative Results
Discussion
הקוונפיקציה של גודל הכבד היא קריטית במחקרים שמטרתם הבנת התפתחות הכבד, התחדשות, ו אונגנזה. הפרוטוקול המתואר כאן הוא טכניקה מהירה יחסית, קלה וזולה לכמת את גודל הכבד בזחל צראדג. הפעלת זהירות מתאימה תוך ביצוע היבטים מסוימים של הפרוטוקול יכולה לסייע בדיוק מוגבר של תוצאות ולהקטין את התסכול.
<p …Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
היינו רוצים להכיר במרין הובס ועל משאבי בעלי החיים מרוכז של דג (הצאר) באוניברסיטת יוטה על מתן גידול בדגים, שטח מעבדה, וציוד לביצוע חלקים של מחקר זה. התרחבות הצאר נתמכת בחלקו על ידי NIH גרנט 1G20OD018369-01. אנחנו גם רוצים להודות רודני סטיוארט, קלואי לים, לאנס גרהאם, קודי ג’יימס, גארט nickum, ואת סרטן הצייד המכון (hci) דג זברה מתקן לטיפול דג זברה. אנחנו רוצים להודות לקנת קומפאס לקבלת עזרה בתכנות R. עבודה זו ממומנת בחלקו על ידי מענקים מן הקרן לסרטן הצייד (בשילוב עם גרנט P30 CA042014 הוענק מכון סרטן הצייד) (KJE) ו-NIH/NCI R01CA222570 (KJE).
Materials
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
- Lin, D. -. C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
- Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).
- Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
- Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
- Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
- Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
- Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
- Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
- Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), 21-28 (2012).
- Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42 (2015).
- Kim, S. -. H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
- Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).
- Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), 1339-1348 (2011).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
