Ferramenta de peixe de DNA Multicolor 3D para estudar arquitetura nuclear em células primárias humanas
Summary
O DNA 3D multicolor FISH representa uma ferramenta para visualizar loci múltiplogenômico dentro de núcleos preservados em 3D, definindo inequivocamente suas interações recíprocas e localização dentro do espaço nuclear em um único nível celular. Aqui, um protocolo passo a passo é descrito para um amplo espectro de células primárias humanas.
Abstract
Uma questão importante na biologia celular é a organização genômica dentro do espaço nuclear e como a arquitetura da cromatina pode influenciar processos como expressão genética, identidade celular e diferenciação. Muitas abordagens desenvolvidas para estudar a arquitetura 3D do genoma podem ser divididas em duas categorias complementares: tecnologias baseadas em captura de conformação cromossa (C-technologies) e imagem. Enquanto o primeiro é baseado na captura da conformação cromossomo e interações de DNA proximal em uma população de células fixas, este último, baseado na fluorescência de DNA na hibridização situ (FISH) em núcleos preservados em 3D, permite a visualização contemporânea de loci múltiplo em um único nível celular (multicolor), examinando suas interações e distribuição dentro do núcleo (3D multicolor DNA FISH). A técnica do DNA 3D multicolor FISH tem uma limitação de visualizar apenas alguns loci pré-determinados, não permitindo uma análise abrangente da arquitetura nuclear. No entanto, dada a robustez de seus resultados, o DNA FISH multicolorido 3D em combinação com microscopia 3D e reconstrução de imagens é um método possível para validar resultados baseados em tecnologia C e estudar inequivocamente a posição e organização de loci específico em um único nível celular. Aqui, propomos um método passo a passo de Peixe sna multicolorido 3D adequado para uma ampla gama de células primárias humanas e discutimos todas as ações práticas, passos cruciais, noções de imagem 3D e análise de dados necessárias para obter uma multicolor 3D bem sucedida e informativa Peixe de DNA em diferentes contextos biológicos.
Introduction
Os eucalitos mais altos precisam condensar sistematicamente e compactar uma enorme quantidade de informações genéticas no espaço 3D do núcleo1,2,3,4. Hoje, sabemos que o genoma é espacialmente encomendado em compartimentos e domínios topologicamente associados5 e que os múltiplos níveis de dobramento de DNA geram contatos entre diferentes regiões genômicas que podem envolver a formação de loop de cromromatina6,7. O looping dinâmico 3D da cromromatina pode influenciar muitos processos biológicos diferentes, como transcrição8,9, diferenciação e desenvolvimento10,11, reparação de DNA12,13, enquanto suas perturbações estão envolvidas em várias doenças14,15,16 e defeitos de desenvolvimento15,17,18.
Muitas abordagens foram desenvolvidas para estudar a organização do genoma 3D. Tecnologias baseadas em conformação cromossa (c-technologies, 3C, 4C, 5C, Hi-C e derivados) foram desenvolvidas para estudar a organização do genoma em células fixas3,4,19,20. Tais abordagens baseiam-se na capacidade de capturar as frequências de contato entre loci genômico na proximidade física. C-tecnologias, dependendo de sua complexidade, capturam a organização global do genoma 3D e a topologia nuclear de uma população celular3,4,19,20. No entanto, as interações 3D são dinâmicas no tempo e no espaço, altamente variáveis entre células individuais que consistem em interações multiplex, e são extensivamente heterogênitas21,22.
Fluorescência de DNA multicolor 3D na hibridização situ (FISH) é uma técnica que permite a visualização de loci genômico específico em um único nível celular, permitindo a investigação direta da arquitetura nuclear 3D de forma complementar às tecnologias C. Representa uma tecnologia atualmente usada para validar inequivocamente os resultados C. O DNA FISH 3D multicolor usa sondas com rótulo fluorescente complementares aos loci genômicos de interesses. O uso de diferentes fluoroforóres e equipamentos adequados de microscopia permitem a visualização contemporânea de múltiplos alvos dentro do espaço nuclear23,24. Nos últimos anos, o FISH tem sido combinado com os avanços tecnológicos na microscopia para obter a visualização de estruturas em escala fina em alta resolução25,26 ou com abordagens CRISPR-Cas para a visualização dos ácidos nucleicos em imagens vivas27,28. Apesar da ampla adoção, a abordagem 3D multicolor DNA FISH ainda é considerada difícil em muitos laboratórios porque o material biológico utilizado deve ser adaptado.
Aqui, fornecemos um protocolo abrangente para peixes de DNA multicoloridos 3D (da preparação celular/sonda à análise de dados) aplicável a uma ampla gama de células primárias humanas, permitindo a visualização de múltiplos loci genômicos e preservando a estrutura 3D de núcleos. Para estudar a arquitetura nuclear, a estrutura 3D dos núcleos deve ser preservada. Por essa razão, contrastando com outros protocolos existentes29,30,31, evitamos o uso de um gradiente de álcool e o armazenamento dos comprovantes de cobertura no álcool que podem afetar a estrutura de cromatina32. O método é adaptado a partir de protocolos de Peixe sna 3D preservados24,33 a serem aplicados a uma ampla gama de células primárias humanas, tanto ex vivo isoladas quanto cultizadas in vitro. Existem parâmetros de permeabilização e desproteína para diferentes características citológicas e citológicas nucleares (por exemplo, diferentes graus de compactação nuclear, abundância de citoesqueleto)34. Esses parâmetros são geralmente descritos em outros protocolos24,33, sem fornecer uma clara discriminação do procedimento dentro de diferentes tipos de células. Além disso, desenvolvemos uma ferramenta específica chamada NuCLεD (localizador de contatos nucleares em 3D)16, fornecendo princípios para análise de dados que melhorarão a proximidade 3D entre diferentes loci e sua distribuição topológica nuclear dentro do espaço nuclear de forma automatizada.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método atual descreve um protocolo passo a passo para executar peixes de DNA multicoloridos 3D em uma ampla gama de células primárias humanas. Embora o DNA FISH seja uma tecnologia em grande uso, o Peixe de DNA multicolorido 3D em núcleos interfásicos 3D preservados ainda é difícil de executar em muitos laboratórios, principalmente devido às características das amostras utilizadas23,24.
A tradução de nick de sonda é um p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem a assistência técnica do INM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare “Romeo ed Enrica Invernizzi” (INGM), Milão, Itália), em particular C. Cordiglieri, para assistência durante imagens 3D multicolor DNA FISH Aquisição. Este trabalho tem sido apoiado pelas seguintes subvenções ao B.B.: Programa principal italiano epigen, Associação Française contre les Myopathies (AFM-Telethon, grant nr 18754) e Giovani Ricercatori, Ministério da Saúde italiano (GR-2011-02349383). Este trabalho tem sido apoiado pela seguinte concessão ao F.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, bolsa nR 2018-0321).
Materials
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Anti-Digoxigenin 488 | DBA | DI7488 | |
| b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bFGF | PeproTech | 100-18B | |
| Biotin 11 d-UTP | Thermo Fisher Scientific | R0081 | |
| BSA (bovine serum albumine) | Sigma | A7030 | |
| Coverlsips | Marienfeld | 117500 | |
| CY3 d-UTP | GE Healthcare | PA53022 | |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D21490 | |
| Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes | Sigma | D7656 | |
| Dextran sulfate (powder) | Santa Cruz | sc-203917A | |
| Digoxigenin 11 d-UTP | Roche | 11093088910 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 21969-035 500mL | |
| DNA polymerase I | Thermo Fisher Scientific | 18010-017 | |
| DNase I | Sigma | AMPD1 | |
| dNTPs (C-G-A-T) | Euroclone | BL0423A/C/G | |
| EGF | Sigma | E9644.2MG | |
| Ethanol | Sigma | 02860-1L | |
| FBS Hyclone | Thermo Fisher Scientific | SH30109 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-25mL | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Glutammine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516-100mL | |
| Glycogen | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| Human Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279-001 | |
| Insulin Human | Sigma | I9278-5 mL | |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) | Sigma | S2889 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-25G | |
| PBS (phosphate-buffered saline) | Sigma | P4417 | |
| Pennycillin/Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 100mL | |
| Pepsin | Biorad | P6887 | |
| PhasePrep BAC DNA Kit | Sigma | NA0100-1KT | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | |
| PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific | K220001 | |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | |
| RNAse cocktail | Thermo Fisher Scientific | AM2288 | |
| Rubbercement | Bostik | ||
| Slides | VWR | 631-0114 | |
| Streptavidina Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | S21374 | |
| Tri-Sodium Citrate | Sigma | 1110379026 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500g | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250mL | |
| TWEEN 20 | Sigma | P9416-100mL |
References
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).
- van Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).
- Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. Spatial genome organization and cognition. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).
- Pombo, A., Dillon, N. Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Therizols, P., et al. Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells. Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).
- Gonzalez-Sandoval, A., et al. Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos. Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).
- Hubner, B., et al. Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments. Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).
- Aymard, F., et al. Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).
- Sellou, H., et al. The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage. Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).
- Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).
- Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
- Cortesi, A., et al. 4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).
- Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits. PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).
- Woltering, J. M., Duboule, D. Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model. Mechanisms of Development. 138, 64-72 (2015).
- de Laat, W., Dekker, J. 3C-based technologies to study the shape of the genome. Methods. 58 (3), 189-191 (2012).
- Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
- Finn, E. H., et al. Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization. Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).
- Zheng, M., et al. Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision. Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).
- Solovei, I. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections. Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).
- Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Chen, B., et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).
- Nelles, D. A., et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell. 165 (2), 488-496 (2016).
- Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures. Current Protocol of Human Genetics. , 15 (2013).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).
- Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP. Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).
- Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).
- Skinner, B. M., Johnson, E. E. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).
- Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
- Beliveau, B. J., et al. Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes. Nature Communication. 6, 7147 (2015).
- Beliveau, B. J., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).
- Samacoits, A., et al. A computational framework to study sub-cellular RNA localization. Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).
- Cardozo Gizzi, A. M., et al. Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms. Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).
- Mateo, L. J., et al. Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).
- Nir, G., et al. Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling. PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).
- Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), (2018).
