ヒト初等細胞の核アーキテクチャを研究する3D多色DNA FISHツール

高い真核生物は、核1、2、3、4の分の3D空間で、膨大な量の遺伝情報を体系的に凝縮し^、コンパクト化する必要があります。今日、我々は、ゲノムが区画およびトポロジー関連ドメイン⁵において空間的に秩序化され、DNAフォールディングの複数のレベルがクロマチンループ形成^6、7を伴う可能性のある異なるゲノム領域間の接触を生成することを知っている。クロマチンの3D動的ループは、転写^8、9、分化および現像10、11、DNA修復12、13、その摂動が様々な疾患14、15、16および発達欠陥^15、17、18に関与している間、多くの異なる生物学的プロセスに影響を及ぼし得^る。

3Dゲノム組織を研究するために多くのアプローチが開発されています。染色体コンフォメーションキャプチャベースの技術(C技術、3C、4C、5C、Hi-Cおよび誘導体)は、固定細胞^{3、4、19、20}のゲノム組織を研究するために開発された。このようなアプローチは、物理的近接でゲノム遺伝子座間の接触周波数を捕捉する能力に基づいている。C-技術は、その複雑さに応じて、細胞集団^{3、4、19、20}のグローバル3Dゲノム組織^と核トポロジーをキャッチします。それにもかかわらず、3D相互作用は時間および空間において動的であり、多重相互作用からなる個々の細胞間で高度に可変であり、かつ広範囲に異種^21、22である。

3D多色DNA蛍光インシトゥハイブリダイゼーション(FISH)は、特定のゲノム軌跡を単一細胞レベルで可視化し、C技術に対して3D核アーキテクチャを補完的に直接調査することを可能にする技術です。これは、C-結果を明確に検証するために現在使用されている技術を表します。3DマルチカラーDNA FISHは、興味のゲノム遺伝子座に相補的な蛍光標識プローブを使用しています。異なる蛍光発光器および適切な顕微鏡装置の使用は核空間^23、24内の複数のターゲットの現代的な視覚化を可能にする。近年、FISHは、マイクロスコピーの技術進歩と組み合わされ、高解像度^25、26、またはCRISPR-Cas法による微細スケール構造の可視化を得て、ライブイメージング^27,28で核酸の可視化を行っている。広く採用されているにもかかわらず、3D多色DNA FISHアプローチは、使用される生物学的材料を適応しなければならないため、多くの研究室では依然として困難であると考えられている。

ここでは、幅広いヒト一次細胞に適用できる3D多色DNA FISH(細胞/プローブ調製からデータ解析まで)の包括的なプロトコルを提供し、多重ゲノム軌跡の可視化を可能にし、核の3D構造を維持します。核建築を研究するためには、核の3D構造を維持しなければならない。このため、他の既存のプロトコル29、30、31とは対照的に、クロマチン構造³²に影響を与えるアルコールのアルコール勾配およびカバースリップの貯蔵の使用を避ける。この方法は、保存された3D DNA FISHプロトコル^24、33から、広範囲のヒト一次細胞に適用されるように適合され、両方とも単離されたエクスビボまたはインビトロで培養される。異なる核形態および細胞学的特性に対する透過性および脱蛋白パラメータ(例えば、異なる核圧縮度、細胞骨格量⁾³⁴がある。これらのパラメータは、一般に、異なる細胞型内での手順の明確な識別を提供することなく、他のプロトコル^24、33で説明される。さらに、核空間内の異なる軌跡とその核トポロジー分布の3D近接性を自動で改善するデータ解析の原理を提供する、NuCLεD(3Dにおける核接触ロケータ⁾¹⁶という特定のツールを開発しました。