3D Multicolor DNA FISH Tool per studiare l'architettura nucleare nelle cellule primarie umane

Gli eucarioti più alti devono condensare e compattare sistematicamente un’enorme quantità di informazioni genetiche nel minuto spazio 3D del nucleo^1,2,3^,4. Oggi sappiamo che il genoma è spazialmente ordinato in compartimenti e domini topologicamente associati⁵ e che i molteplici livelli di riduzione del DNA generano contatti tra diverse regioni genomiche che possono comportare la formazione di loop della cromatina^6,7. Il loop dinamico 3D della cromatina può influenzare molti processi biologici diversi come la trascrizione^8,9, la differenziazione e lo sviluppo^10,11, riparazione del DNA^12,13, mentre le sue perturbazioni sono coinvolte in varie malattie^14,15,16 e difetti dello sviluppo^15,17,18.

Molti approcci sono stati sviluppati per studiare l’organizzazione del genoma 3D. Tecnologie basate sulla conformazione cromosomica (tecnologie C, 3C, 4C, 5C, Hi-C e derivati) sono state sviluppate per studiare l’organizzazione del genoma nelle cellule fisse^3,4,19,20. Tali approcci si basano sulla capacità di catturare le frequenze di contatto tra loci genomici in prossimità fisica. Le tecnologie C, a seconda della loro complessità, catturano l’organizzazione globale del genoma 3D e la topologia nucleare di una popolazione cellulare^3,4,19,20. Tuttavia, le interazioni 3D sono dinamiche nel tempo e nello spazio, altamente variabili tra singole cellule costituite da interazioni multiplex, e sono ampiamente eterogenee^21,22.

La fluorescenza 3D multicolore del DNA nell’ibridazione situ (FISH) è una tecnica che consente la visualizzazione di loci genomici specifici a livello di singola cellula, consentendo lo studio diretto dell’architettura nucleare 3D in modo complementare alle tecnologie C. Rappresenta una tecnologia attualmente utilizzata per convalidare in modo inequivocabile i risultati C. IL DNA FISH multicolore 3D utilizza sonde etichettate fluorescentmente complementari ai loci genomici di interessi. L’uso di diversi fluorofori e attrezzature di microscopia idonee consentono la visualizzazione contemporanea di più obiettivi all’interno dello spazio nucleare^23,24. Negli ultimi anni, FISH è stato combinato con i progressi tecnologici nella microscopia per ottenere la visualizzazione di strutture su scala fine ad alta risoluzione^25,26 o con approcci CRISPR-Cas per la visualizzazione degli acidi nucleici nell’imaging dal vivo^27,28. Nonostante l’ampia adozione, l’approccio 3D multicolore DNA FISH è ancora considerato difficile in molti laboratori perché il materiale biologico utilizzato deve essere adattato.

Qui, forniamo un protocollo completo per il DNA FISH multicolore 3D (dalla preparazione di cellule/sonde all’analisi dei dati) applicabile a un’ampia gamma di cellule primarie umane, consentendo la visualizzazione di più loci genomici e preservando la struttura 3D dei nuclei. Per studiare l’architettura nucleare, la struttura 3D dei nuclei deve essere preservata. Per questo motivo, a differenza di altri protocolli esistenti^29,30,31, evitiamo l’uso di un gradiente di alcol e lo stoccaggio dei copricapi nell’alcool che possono influenzare la struttura della cromatina³². Il metodo è adattato dai protocolli 3D DNA FISH conservati^24,33 da applicare a una vasta gamma di cellule primarie umane, sia isolate ex vivo che coltivate in vitro. Ci sono parametri di permeabilizzazione e deproteinizzazione per diverse morfologia nucleare e caratteristiche citologiche (ad esempio, diversi gradi di compattazione nucleare, abbondanza di citoscheletri)³⁴. Questi parametri sono spesso generalmente descritti in altri protocolli^24,33, senza fornire una chiara discriminazione della procedura all’interno di diversi tipi di cellule. Inoltre, abbiamo sviluppato uno strumento specifico chiamato NuCLsD (localizzatore di contatti nucleari in 3D)¹⁶, fornendo principi per l’analisi dei dati che miglioreranno la vicinanza 3D tra diversi loci e la loro distribuzione topologica nucleare all’interno dello spazio nucleare in modo automatizzato.