3D متعدد الألوان أداة الحمض النووي الأسماك لدراسة العمارة النووية في الخلايا الأساسية البشرية
Summary
تمثل الـ DNA FISH ثلاثية الأبعاد أداة لتصور اللوية الجينومية المتعددة داخل النوى المحفوظة ثلاثية الأبعاد، مع تحديد تفاعلاتها المتبادلة وتوطينها بشكل لا لبس فيه داخل الفضاء النووي على مستوى خلية واحدة. هنا ، يتم وصف بروتوكول خطوة بخطوة لمجموعة واسعة من الخلايا الأساسية البشرية.
Abstract
والسؤال الرئيسي في بيولوجيا الخلايا هو تنظيم الجينوم داخل الفضاء النووي وكيف يمكن أن تؤثر بنية الكروماتين على عمليات مثل التعبير الجيني وهوية الخلية والتمايز. يمكن تقسيم العديد من النُهج التي تم تطويرها لدراسة العمارة ثلاثية الأبعاد للجينوم إلى فئتين متكاملتين: التقنيات القائمة على التقاط تشكيل الكروموسوم (C-technologies) والتصوير. في حين أن الأول يقوم على التقاط تشكيل الكروموسوم والتفاعلات الحمض النووي القريب في مجموعة من الخلايا الثابتة ، وهذا الأخير ، على أساس تهجين الحمض النووي في الموقع (FISH) على النوى 3D الحفاظ عليها ، يسمح التصور المعاصر لل loci متعددة على مستوى خلية واحدة (متعددة الألوان)، ودراسة تفاعلاتها وتوزيعها داخل نواة (3D متعدد الألوان الحمض النووي الأسماك). تقنية ثلاثية الأبعاد للحمض النووي متعدد الألوان FISH لديها حد من تصور سوى عدد قليل من loci المحددة مسبقا، لا يسمح بإجراء تحليل شامل للبنية النووية. ومع ذلك ، نظرا لمتانة نتائجها ، 3D متعدد الألوان الحمض النووي الأسماك في تركيبة مع المجهر 3D وإعادة بناء الصورة هو وسيلة ممكنة للتحقق من صحة النتائج القائمة على التكنولوجيا جيم ودراسة لا لبس فيها موقف وتنظيم loci محددة على مستوى خلية واحدة. هنا ، نقترح طريقة خطوة بخطوة من 3D متعدد الألوان DNA FISH مناسبة لمجموعة واسعة من الخلايا الأساسية البشرية ومناقشة جميع الإجراءات العملية والخطوات الحاسمة ومفاهيم التصوير ثلاثي الأبعاد وتحليل البيانات اللازمة للحصول على ثلاثية الألوان ناجحة وغنية بالمعلومات الحمض النووي الأسماك في سياقات بيولوجية مختلفة.
Introduction
تحتاج eukaryotes أعلى إلى تكثيف منهجي والتعاقد على كمية كبيرة من المعلومات الوراثية في الفضاء 3D دقيقة من نواة1،2،3،4. اليوم ، ونحن نعلم أن يتم ترتيب الجينوم مكانيا في المقصورات والمجالات المرتبطة طوبولوجية5 ، وأن مستويات متعددة من طي الحمض النووي تولد الاتصالات بين مناطق الجينوم المختلفة التي قد تنطوي على تكوين حلقة الكروماتين6،7. يمكن للحلقات الديناميكية ثلاثية الأبعاد من الكروماتين أن تؤثر على العديد من العمليات البيولوجية المختلفة مثل النسخ8،9، التمايز والتطوير10،11، إصلاح الحمض النووي12،13، في حين تشارك اضطراباته في أمراض مختلفة14،15،16 وعيوب النمو15،17،18.
وقد تم تطوير العديد من النهج لدراسة تنظيم الجينوم 3D. الكروموسوم الالتقاط التكنولوجيات القائمة على (C-التكنولوجيات، 3C، 4C، 5C، مرحبا-C والمشتقات) وقد وضعت لدراسة تنظيم الجينوم في الخلايا الثابتة3،4،19،20. وتستند هذه النُهج إلى القدرة على التقاط ترددات الاتصال بين موضع الجينوم في القرب المادي. C-التكنولوجيات، اعتمادا على تعقيدها، وقبض على منظمة الجينوم 3D العالمية والطوبولوجيا النووية من عدد الخلايا3،4،19،20. ومع ذلك ، فإن التفاعلات ثلاثية الأبعاد ديناميكية في الزمان والمكان ، ومتغيرة للغاية بين الخلايا الفردية التي تتكون من تفاعلات متعددة ، وهي غير متجانسة على نطاق واسع21،22.
تُعنى تقنية التهجين ثلاثي الأبعاد للحمض النووي متعدد الألوان في الموقع (FISH) بتصور موضع جينومي محدد على مستوى خلية واحدة، مما يتيح إجراء تحقيق مباشر في البنية النووية ثلاثية الأبعاد بطريقة مكملة لتقنيات C. وهو يمثل تكنولوجيا تستخدم حاليا للتحقق من صحة النتائج C بشكل لا لبس فيه. يستخدم الحمض النووي ثلاثي الأبعاد متعدد الألوان FISH مسابر ذات علامة فلورية مكملة لموضع الجينوم للاهتمامات. استخدام الفلوروفوريات المختلفة ومعدات المجهر مناسبة تسمح التصور المعاصر لأهداف متعددة داخل الفضاء النووي23،24. في السنوات الأخيرة ، تم دمج FISH مع التقدم التكنولوجي في المجهر للحصول على تصور الهياكل ذات النطاق الدقيق بدقةعالية 25،26 أو مع نهج CRISPR-Cas لتصور الأحماض النووية في التصوير الحي27،28. على الرغم من اعتماد واسع النطاق، لا يزال نهج الحمض النووي متعدد الألوان متعدد الألوان يعتبر صعبًا في العديد من المختبرات لأنه يجب تكييف المواد البيولوجية المستخدمة.
هنا ، نقدم بروتوكولًا شاملًا لـ 3D MULTIColor DNA FISH (من إعداد الخلية / المسبار إلى تحليل البيانات) ينطبق على مجموعة واسعة من الخلايا الأساسية البشرية ، مما يتيح تصور loci الجينومية المتعددة والحفاظ على بنية 3D من النوى. من أجل دراسة العمارة النووية ، يجب الحفاظ على هيكل النوى ثلاثية الأبعاد. لهذا السبب ، على النقيض من البروتوكولات القائمة الأخرى29،30،31، نتجنب استخدام تدرج الكحول وتخزين القسائم في الكحول التي يمكن أن تؤثر على بنية الكروماتين32. يتم تكييف هذه الطريقة من الحفاظ على بروتوكولات الحمض النووي 3D FISH24،33 ليتم تطبيقها على مجموعة واسعة من الخلايا الأساسية البشرية ، سواء المعزولة في الجسم الحي السابق أو المستزرعة في المختبر. هناك معلمات permeabilization وإزالة البروتينة لمختلف مورفولوجيا النووية والخصائص الخلوية (على سبيل المثال، درجات مختلفة من الضغط النووي، وفرة الهيكل الخلوي)34. وغالباً ما توصف هذه المعلمات عموماً في بروتوكولات أخرى24،33، دون تقديم تمييز واضح للإجراء داخل أنواع الخلايا المختلفة. وعلاوة على ذلك، قمنا بتطوير أداة محددة تسمى NuCLаD (محدد مواقع الاتصالات النووية في 3D)16، وتوفير مبادئ لتحليل البيانات من شأنها تحسين القرب ثلاثي الأبعاد بين أماكن مختلفة وتوزيعها الطوبولوجي النووي داخل الفضاء النووي بطريقة آلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف الطريقة الحالية بروتوكولًا خطوة بخطوة لتنفيذ الحمض النووي ثلاثي الأبعاد متعدد الألوان FISH على مجموعة واسعة من الخلايا الأساسية البشرية. على الرغم من أن الحمض النووي FISH هو تقنية في الاستخدام الواسع ، فإن الحمض النووي ثلاثي الأبعاد FISH على النوى ثلاثية الأبعاد المحفوظة لا يزال من الصعب ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر المؤلفون بالمساعدة التقنية التي يقدمها مرفق التصوير INGM (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare “Romeo ed Enrica Invernizzi” (INGM)، ميلانو، إيطاليا)، ولا سيما C. Cordiglieri، للحصول على المساعدة خلال صور الحمض النووي ثلاثي الأبعاد متعدد الألوان اقتناء. وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنح التالية إلى B.B.: برنامج EPIGEN الإيطالي الرائد ، جمعية Française contre les Myopathies (AFM-Telethon ، منحة NR 18754) وجيوفاني رايسركاتوري ، وزارة الصحة الإيطالية (GR-2011-02349383). وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنحة التالية لF.M.: فوندازيون كاريبلو (باندو جيوفاني، منحة NR 2018-0321).
Materials
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Anti-Digoxigenin 488 | DBA | DI7488 | |
| b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bFGF | PeproTech | 100-18B | |
| Biotin 11 d-UTP | Thermo Fisher Scientific | R0081 | |
| BSA (bovine serum albumine) | Sigma | A7030 | |
| Coverlsips | Marienfeld | 117500 | |
| CY3 d-UTP | GE Healthcare | PA53022 | |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D21490 | |
| Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes | Sigma | D7656 | |
| Dextran sulfate (powder) | Santa Cruz | sc-203917A | |
| Digoxigenin 11 d-UTP | Roche | 11093088910 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 21969-035 500mL | |
| DNA polymerase I | Thermo Fisher Scientific | 18010-017 | |
| DNase I | Sigma | AMPD1 | |
| dNTPs (C-G-A-T) | Euroclone | BL0423A/C/G | |
| EGF | Sigma | E9644.2MG | |
| Ethanol | Sigma | 02860-1L | |
| FBS Hyclone | Thermo Fisher Scientific | SH30109 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-25mL | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Glutammine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516-100mL | |
| Glycogen | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| Human Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279-001 | |
| Insulin Human | Sigma | I9278-5 mL | |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) | Sigma | S2889 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-25G | |
| PBS (phosphate-buffered saline) | Sigma | P4417 | |
| Pennycillin/Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 100mL | |
| Pepsin | Biorad | P6887 | |
| PhasePrep BAC DNA Kit | Sigma | NA0100-1KT | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | |
| PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific | K220001 | |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | |
| RNAse cocktail | Thermo Fisher Scientific | AM2288 | |
| Rubbercement | Bostik | ||
| Slides | VWR | 631-0114 | |
| Streptavidina Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | S21374 | |
| Tri-Sodium Citrate | Sigma | 1110379026 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500g | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250mL | |
| TWEEN 20 | Sigma | P9416-100mL |
References
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).
- van Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).
- Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. Spatial genome organization and cognition. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).
- Pombo, A., Dillon, N. Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Therizols, P., et al. Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells. Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).
- Gonzalez-Sandoval, A., et al. Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos. Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).
- Hubner, B., et al. Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments. Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).
- Aymard, F., et al. Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).
- Sellou, H., et al. The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage. Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).
- Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).
- Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
- Cortesi, A., et al. 4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).
- Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits. PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).
- Woltering, J. M., Duboule, D. Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model. Mechanisms of Development. 138, 64-72 (2015).
- de Laat, W., Dekker, J. 3C-based technologies to study the shape of the genome. Methods. 58 (3), 189-191 (2012).
- Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
- Finn, E. H., et al. Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization. Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).
- Zheng, M., et al. Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision. Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).
- Solovei, I. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections. Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).
- Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Chen, B., et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).
- Nelles, D. A., et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell. 165 (2), 488-496 (2016).
- Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures. Current Protocol of Human Genetics. , 15 (2013).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).
- Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP. Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).
- Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).
- Skinner, B. M., Johnson, E. E. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).
- Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
- Beliveau, B. J., et al. Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes. Nature Communication. 6, 7147 (2015).
- Beliveau, B. J., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).
- Samacoits, A., et al. A computational framework to study sub-cellular RNA localization. Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).
- Cardozo Gizzi, A. M., et al. Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms. Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).
- Mateo, L. J., et al. Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).
- Nir, G., et al. Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling. PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).
- Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), (2018).
