JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

3D Multicolor DNA FISH Tool om nucleaire architectuur in menselijke primaire cellen te bestuderen

Published: January 25, 2020
doi:
10.3791/60712
, , ,
1Istituto Nazionale di Genetica Molecolare “Romeo ed Enrica Invernizzi”, INGM

Summary

3D multicolor DNA FISH vertegenwoordigt een hulpmiddel om meerdere genomische loci binnen 3D bewaarde kernen te visualiseren, ondubbelzinnig definiëren d.m.v. hun wederzijdse interacties en lokalisatie binnen de nucleaire ruimte op één celniveau. Hier wordt een stap voor stap protocol beschreven voor een breed spectrum van menselijke primaire cellen.

Abstract

Een belangrijke vraag in de celbiologie is genomische organisatie binnen de nucleaire ruimte en hoe chromatinearchitectuur processen zoals genexpressie, celidentiteit en differentiatie kan beïnvloeden. Veel benaderingen ontwikkeld om de 3D-architectuur van het genoom te bestuderen, kunnen worden onderverdeeld in twee complementaire categorieën: chromosoom-conformatie capture gebaseerde technologieën (C-technologieën) en beeldvorming. Terwijl de eerste is gebaseerd op het vastleggen van de chromosoom-conformatie en proximale DNA-interacties in een populatie van vaste cellen, de laatste, gebaseerd op DNA fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) op 3D-bewaarde kernen, maakt hedendaagse visualisatie van meerdere loci op een enkelcelniveau (veelkleurig), het onderzoeken van hun interacties en distributie binnen de kern (3D multicolor DNA FISH). De techniek van 3D multicolor DNA FISH heeft een beperking van het visualiseren van slechts een paar vooraf bepaalde loci, niet toestaan dat een uitgebreide analyse van de nucleaire architectuur. Echter, gezien de robuustheid van de resultaten, 3D multicolor DNA FISH in combinatie met 3D-microscopie en beeldreconstructie is een mogelijke methode om C-technologie gebaseerde resultaten te valideren en ondubbelzinnig de positie en organisatie van specifieke loci te bestuderen op één celniveau. Hier stellen we een stapsgewijze methode voor van 3D multicolor DNA FISH die geschikt is voor een breed scala aan menselijke primaire cellen en bespreken we alle praktische acties, cruciale stappen, noties van 3D-beeldvorming en data-analyse die nodig zijn om een succesvolle en informatieve 3D-multicolor te verkrijgen DNA VIS binnen verschillende biologische contexten.

Introduction

Hogere eukaryoten moeten systematisch condenseren en compacteen enorme hoeveelheid genetische informatie in de minuut 3D-ruimte van de kern1,2,3,4. Vandaag de dag weten we dat het genoom ruimtelijk wordt geordend in compartimenten en topologische geassocieerde domeinen5 en dat de vele niveaus van DNA vouwen contacten genereren tussen verschillende genomische regio’s die chromatine lusvorming kunnen betrekken6,7. De 3D dynamische lus van chromatine kan invloed hebben op veel verschillende biologische processen, zoals transcriptie8,9, differentiatie en ontwikkeling10,11, DNA-reparatie12,13, terwijl de verstoringen zijn betrokken bij verschillende ziekten14,15,16 en ontwikkelingsfouten15,17,18.

Er zijn veel benaderingen ontwikkeld om de 3D-genoomorganisatie te bestuderen. Chromosoom conformatie capture-gebaseerde technologieën (C-technologieën, 3C, 4C, 5C, Hi-C en derivaten) zijn ontwikkeld om genoom organisatie te bestuderen in vaste cellen3,4,19,20. Dergelijke benaderingen zijn gebaseerd op de mogelijkheid om de contactfrequenties tussen genomische loci in fysieke nabijheid vast te leggen. C-technologieën, afhankelijk van hun complexiteit, vangen de wereldwijde 3D-genoomorganisatie en nucleaire topologie van een celpopulatie3,4,19,20. Niettemin zijn 3D-interacties dynamisch in tijd en ruimte, zeer variabel tussen individuele cellen bestaande uit multiplex interacties, en zijn op grote schaal heterogeen21,22.

3D multicolor DNA fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is een techniek die het mogelijk maakt de visualisatie van specifieke genomic loci op een cell niveau, waardoor direct onderzoek van de 3D nucleaire architectuur op een complementaire manier aan C-technologieën. Het vertegenwoordigt een technologie die momenteel wordt gebruikt om c-resultaten ondubbelzinnig te valideren. 3D multicolor DNA FISH maakt gebruik van fluorescerende gelabelde sondes die complementair zijn aan de genomische loci van belangen. Het gebruik van verschillende fluorophores en geschikte microscopieapparatuur maken het mogelijk om meerdere doelen binnen de nucleaire ruimte23,24, op een eigentijdse manier te visualiseren. In de afgelopen jaren is FISH gecombineerd met technologische vooruitgang in microscopie om de visualisatie van fijnschaalstructuren te verkrijgen bij hoge resolutie25,26 of met CRISPR-Cas benaderingen voor de visualisatie van de nucleïnezuren in live imaging27,28. Ondanks de brede adoptie wordt de 3D-multicolor DNA FISH-benadering in veel laboratoria nog steeds als moeilijk beschouwd omdat het gebruikte biologische materiaal moet worden aangepast.

Hier bieden we een uitgebreid protocol voor 3D-multicolor DNA FISH (van cel/sondevoorbereiding tot data-analyse) die van toepassing is op een breed scala aan menselijke primaire cellen, waardoor de visualisatie van meerdere genomische loci mogelijk is en de 3D-structuur van kernen behouden blijft. Om de nucleaire architectuur te bestuderen, moet de 3D-structuur van kernen behouden blijven. Om deze reden vermijden we, in tegenstelling tot andere bestaande protocollen29,30,31, het gebruik van een alcoholgradiënt en de opslag van de afdekkingen in alcohol die chromatinestructuur32kunnen beïnvloeden . De methode is aangepast van bewaarde 3D DNA FISH protocollen24,33 die moeten worden toegepast op een breed scala van menselijke primaire cellen, zowel geïsoleerd ex vivo of gekweekt in vitro. Er zijn permeabilisatie- en deproteinisatieparameters voor verschillende nucleaire morfologie en cytologische kenmerken (bijvoorbeeld verschillende graden van nucleaire verdichting, cytoskeletovervloed)34. Deze parameters worden vaak over het algemeen beschreven in andere protocollen24,33, zonder een duidelijke discriminatie van de procedure binnen verschillende celtypen. Verder hebben we een specifiek instrument ontwikkeld genaamd NuCLεD (nuclear contacts locator in 3D)16, die principes biedt voor data-analyse die de 3D-nabijheid tussen verschillende loci en hun nucleaire topologische distributie binnen de nucleaire ruimte op een geautomatiseerde manier zullen verbeteren.

Protocol

1. DNA-sondevoorbereidings- en etiketteringsprocedures met nick-vertaling Zuiveren en reinigen van bacteriële kunstmatige chromosomen (BACs), plasmiden of PCR producten met specifieke kits (Tabel van materialen), resuspend in ddH2O, controleren door elektroforese op een agarose gel en kwantificeren. Voer nick vertaling op 1,5−2 μg DNA uit stap 1.1 in een laatste volume van 50 μL door het mengen van alle reagentia in een 0,5 mL lage binding S-buis volgens tabel …

Representative Results

De methode van 3D multicolor DNA FISH beschreven in dit artikel maakt hedendaagse visualisatie van verschillende genomische loci binnen bewaard 3D-kernen(Figuur 1B) mogelijk. Dit protocol maakt het mogelijk afstanden tussen allelen en verschillende genomic loci meten te meten om de ruimtelijke nabijheid ervan te evalueren en de ligging ervan in de nucleaire ruimte te beoordelen (bijvoorbeeld loci-afstand van de centroid of de periferie van de kernen)16</sup…

Discussion

De huidige methode beschrijft een stap voor stap protocol om 3D multicolor DNA FISH uit te voeren op een breed scala van menselijke primaire cellen. Hoewel DNA FISH een technologie is in breed gebruik, is 3D-multicolor DNA VIS op bewaarde 3D-interfasekernen nog steeds moeilijk uit te voeren in veel laboratoria, voornamelijk vanwege de kenmerken van de gebruikte monsters23,24.

Probe nick vertaling is een fundamentele stap voor succesvol…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs erkennen de technische bijstand van de INGM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Molecolare “Romeo ed Enrica Invernizzi” (INGM), Milaan, Italië), in het bijzonder C. Cordiglieri, voor hulp bij 3D multicolor DNA FISH-beelden Verwerving. Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies aan B.B.: EPIGEN Italiaans vlaggenschipprogramma, Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon, grant nr 18754) en Giovani Ricercatori, Italiaans ministerie van Volksgezondheid (GR-2011-02349383). Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidie aan F.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321).

Materials

24-well plates Thermo Fisher Scientific 142475
6-well plates Thermo Fisher Scientific 140675
Anti-Digoxigenin 488 DBA DI7488
b-Mercaptoethanol Sigma M3148
bFGF PeproTech 100-18B
Biotin 11 d-UTP Thermo Fisher Scientific R0081
BSA (bovine serum albumine) Sigma A7030
Coverlsips Marienfeld 117500
CY3 d-UTP GE Healthcare PA53022
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) Thermo Fisher Scientific D21490
Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes Sigma D7656
Dextran sulfate (powder) Santa Cruz sc-203917A
Digoxigenin 11 d-UTP Roche 11093088910
DMEM Thermo Fisher Scientific 21969-035 500mL
DNA polymerase I Thermo Fisher Scientific 18010-017
DNase I Sigma AMPD1
dNTPs (C-G-A-T) Euroclone BL0423A/C/G
EGF Sigma E9644.2MG
Ethanol Sigma 02860-1L
FBS Hyclone Thermo Fisher Scientific SH30109
Formaldehyde solution Sigma F8775-25mL
Formamide Sigma F9037
Glutammine Thermo Fisher Scientific 25030-024 100mL
Glycerol Sigma G5516-100mL
Glycogen Thermo Fisher Scientific AM9510
HCl Sigma 30721
Human Cot-1 DNA Thermo Fisher Scientific 15279-001
Insulin Human Sigma I9278-5 mL
MgCl2 Sigma 63069
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) Sigma S2889
NaCl Sigma S9888
Paraformaldehyde Sigma 158127-25G
PBS (phosphate-buffered saline) Sigma P4417
Pennycillin/Streptavidin Thermo Fisher Scientific 15070-063 100mL
Pepsin Biorad P6887
PhasePrep BAC DNA Kit Sigma NA0100-1KT
Poly-L-lysine solution Sigma P8920
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36970
PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit Thermo Fisher Scientific K220001
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit Thermo Fisher Scientific K210010
RNAse cocktail Thermo Fisher Scientific AM2288
Rubbercement Bostik
Slides VWR 631-0114
Streptavidina Alexa fluor 647 Thermo Fisher Scientific S21374
Tri-Sodium Citrate Sigma 1110379026
Tris-HCl Sigma T3253-500g
Triton X-100 Sigma T8787-250mL
TWEEN 20 Sigma P9416-100mL
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
  2. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  3. Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
  4. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).
  5. van Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).
  6. Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. Spatial genome organization and cognition. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).
  7. Pombo, A., Dillon, N. Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).
  8. Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
  9. Therizols, P., et al. Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells. Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).
  10. Gonzalez-Sandoval, A., et al. Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos. Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).
  11. Hubner, B., et al. Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments. Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).
  12. Aymard, F., et al. Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).
  13. Sellou, H., et al. The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage. Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).
  14. Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).
  15. Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
  16. Cortesi, A., et al. 4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).
  17. Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits. PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).
  18. Woltering, J. M., Duboule, D. Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model. Mechanisms of Development. 138, 64-72 (2015).
  19. de Laat, W., Dekker, J. 3C-based technologies to study the shape of the genome. Methods. 58 (3), 189-191 (2012).
  20. Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
  21. Finn, E. H., et al. Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization. Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).
  22. Zheng, M., et al. Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision. Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).
  23. Solovei, I. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections. Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).
  24. Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).
  25. Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
  26. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  27. Chen, B., et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).
  28. Nelles, D. A., et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell. 165 (2), 488-496 (2016).
  29. Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures. Current Protocol of Human Genetics. , 15 (2013).
  30. Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).
  31. Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP. Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).
  32. Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).
  33. Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).
  34. Skinner, B. M., Johnson, E. E. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).
  35. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
  36. Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
  37. Beliveau, B. J., et al. Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes. Nature Communication. 6, 7147 (2015).
  38. Beliveau, B. J., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).
  39. Samacoits, A., et al. A computational framework to study sub-cellular RNA localization. Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).
  40. Cardozo Gizzi, A. M., et al. Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms. Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).
  41. Mateo, L. J., et al. Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).
  42. Nir, G., et al. Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling. PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).
  43. Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), (2018).

Tags

3D Multicolor DNA FISHNuclear ArchitectureGenomic LociChromosome CaptureNick TranslationProbe PrecipitationCell FixationPermeabilizationRNAse Treatment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Marasca, F., Cortesi, A., Manganaro, L., Bodega, B. 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells. J. Vis. Exp. (155), e60712, doi:10.3791/60712 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image