Убиквитин Цепной Анализ параллельным мониторингом реакции

Тесная регуляции белковой функции и стабильности имеет первостепенное значение, поскольку они являются основными факторами фенотипического контроля биологии. Функция белка построена из двух компонентов: его внутренней полипептидной последовательности и любых посттрансляционных модификаций (ПТМ). Были выявлены различные химические ПТС, включая гликозилирование, фосфорилирование, ацетилирование и метилирование^1. В 1975 году Гольдштейн и др.^{2 определили небольшой} белок и назвали его убиквитином из-за его вездесущей природы. Убиквитин оказался важным в деградации белка³. Однако с тех пор было установлено, что функция убиквитина как сигнальной молекулы выходит далеко за рамки регуляции белковой стабильности. Убиквитин сигнализации участвует в широком спектре других биологических функций, таких как стабилизация белка, аутофагия, контроль клеточного цикла, и торговля^{белками 4}.

В то время как другие ПТМ, как правило, двоичные (т.е. белок изменяется или остается неизмененным) для данного сайта, убиквитин может модифицировать белок как мономер, так и как полимерную цепь, при этом сам убиквитин прикрепляется. Кроме того, эта цепочка полиубикитинации может развиваться в нескольких топологиях с убиквититацией предыдущего убиквитина, прикрепляемого к одному из^{восьми мест связи 5,6.} Убиквитин передается многоступенчатым энзиматический процесс (Рисунок 1), где C-терминус убиквитина связан с одним из семи остатков лизина (K06, K11, K27, K29, K33, K48, или K63) или N-терминал предыдущего убиквитина (называется M1 или линейной убиквитина)^5. Эта топология цепи является ключом к судьбе белка в модификации. Например, модификация с цепочкой K48 или K11 приводит к деградации модифицированного белка у протеасомы, в то время как линейная цепь необходима для активации сигнализации NF-kB. Таким образом, относительное распределение этих цепных топологий имеет отношение к широкому кругу биологических вопросов.

Использование масс-спектрометрии (MS) имеет особое значение для анализа топологии цепи убиквитина, поскольку она не зависит от антител на основе или сродства на^{основе взаимодействий 7,8}, многие из которых имеют ограниченную специфичность и не различают различные типы цепи. Другая возможность обнаружения использует генетически модифицированных мутантов убиквитина. Здесь на аргинин обменивается специфический лизин, который не может поддерживать модификацию убиквитином. Отсутствие образования цепи убиквитина на субстратовый белок затем интерпретируется как доказательство для конкретной топологии⁹.

MS-идентификация убиквитинированных белков основана на том факте, что C-терминус убиквитина содержит остатки аргинина в положении 74, который распознается трипсином во время протеолитического приготовления образцов для анализа MS, отделяя C-терминальный двойной глицин. Этот GlyGly (-GG) остается ε к группе аминокислот лизина остатков субстрата белка. Для анализа топологии убиквитина, модификация происходит на одном из семи остатков лизина убиквитина. Это создает набор из семи ключевых пептидов, которые несут остатки лизина, который изменяется GG, специфичный для каждой из топологий(рисунок 2). Например, с K06 топологии, лизин на позиции 6 на аминокислотной последовательности будут защищены от триптического пищеварения с -GG модификации 114 Da добавил к этому лизин.

Идентификация конкретных предопределенных пептидов MS называется целевой протеомией, или, более конкретно, целевым приобретением пептида^10. В зависимости от производительности используемого масс-спектрометра разработаны два метода. Это отдельный мониторинг реакции (SRM), также называемый множественным мониторингом реакции (MRM), и параллельный мониторинг реакции (PRM). SRM включает в себя выбор переходов, состоящий из прекурсора m/z и продукта ион m/z. И наоборот, PRM требует только прекурсора m/z. После выбора выполняется полное обследование ионов продукта. Это имеет то преимущество, что никакой выбор соответствующих ионов продукта для количественной оценки на конкретный масс-спектрометр не требуется до^{измерения 11}. И SRM, и PRM могут, в зависимости от инструмента, быть запланированы. Планирование – это практика присвоения тайм-окну, в течение которого определенный ион будет включен для анализа, так как пептиды eluting в определенное время удержания из хроматографической системы. Сокращение числа ионов, допрашиваемых в любой момент времени, увеличивает частоту допросов тех ионов, которые были запланированы в то время, тем самым повышая точность данных.

В целом, применение целевой протеомики для убиквитин топологии такой же, как и любой другой целенаправленный эксперимент протеомика. Однако важны два ключевых отличия: во-первых, необходимо учитывать стабильность убиквитиных цепей. Существует несколько мощных деубикитинирующих ферментов (ДУБ), которые быстро деградируют цепи при клеточномлизе. Протеазы, специфичные для убиквитина, подразнятся на две категории: тиоэстеразы и металлопротеазы. Большинство убиквитин-гидролазы являются тиоэстеразы и нести остатки цистеина в их активном центре. Путем alkylating этот остаток цистеин, они могут быть инактивированы. Таким образом, использование буферов стабилизации убиквитина, содержащих алкилатные агенты, такие как N-этилмалеимид (NEM), и высоко денатурированных химических веществ, и сохранение образцов охлажденными имеет жизненно важное значение для успешного анализа. Во-вторых, в отличие от других целевых экспериментов, выбор пептида фиксируется. В типичном целевом эксперименте протеотипический пептид может быть выбран для хорошей хроматографической и ионизации. Для некоторых топологически-характерных пептидов, таких как K48 эти свойства хороши, в то время как для других, они менее желательны. Например, хроматография K33 в типичной установке обратной фазы плоха из-за формирования растянутого профиля элюции, а плохие свойства ионизации пептида K27 снижают его видимость на MS^12.

В этом протоколе мы описываем, как выполнить туплологическую оценку убиквитина биологического образца PRM. Примерные данные для процедуры представлены с использованием возмущения протеасомы с помощью ингибитора MG-132 лечения в нескольких различных типов клеток.