병렬 반응 모니터링에 의한 유비퀴틴 연쇄 분석
Summary
이 방법은 유비퀴틴 체인 토폴로지의 글로벌 변화에 대한 평가를 설명합니다. 평가는 질량 분광계 기지를 둔 표적 proteomics 접근의 응용에 의해 수행됩니다.
Abstract
프로테오메 내의 유비퀴틴 사슬 토폴로지의 글로벌 프로필에 대한 평가는 광범위한 생물학적 질문에 답하는 데 관심이 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 사슬에 통합된 유비퀴틴의 트립틱 소화 후 남은 디 글리신(-GG) 수정을 활용합니다. 이러한 토폴로지 특성 펩티드를 정량화함으로써 각 유비퀴틴 사슬 토폴로지의 상대적 풍부를 결정할 수 있다. 병렬 반응 모니터링 실험에 의해 이러한 펩티드를 정량화하는 데 필요한 단계는 유비퀴틴 사슬의 안정화를 고려하여 보고된다. 무거운 컨트롤, 세포 리시스 및 소화의 준비는 적절한 질량 분광계 설정 및 데이터 분석 워크플로우와 함께 설명됩니다. 유비퀴틴 토폴로지에 대한 혼란을 가진 예제 데이터 세트가 제공되며 프로토콜의 최적화가 결과에 미치는 영향에 대한 예제가 함께 제공됩니다. 설명된 단계를 수행함으로써 사용자는 생물학적 맥락에서 유비퀴틴 토폴로지 환경에 대한 글로벌 평가를 수행할 수 있습니다.
Introduction
단백질 기능 과 안정성의 가까운 조절은 가장 중요 한 중요 한, 그들은 생물학의 phenotypic 제어의 주요 드라이버로. 단백질의 기능은 두 가지 구성 요소로 구성됩니다: 본질적인 폴리펩티드 서열 및 번역 후 변형(PTM). 글리코실화, 인산화, 아세틸화 및 메틸화1을포함한 다양한 화학적 PTM이 확인되었다. 1975년, Goldstein외. 2는 작은 단백질을 확인하고 유비쿼터스 특성으로 인해 유비퀴틴이라고 명명했습니다. 유비퀴틴은 단백질 분해3에서중요한 것으로 나타났다. 그러나, 그 이후로 신호 분자로서의 유비퀴틴의 기능이 단백질 안정성조절을 훨씬 뛰어넘는 것으로 확립되었다. 유비퀴틴 시그널링은 단백질 안정화, 자가식, 세포 주기 제어 및 단백질 인신 매매4와같은 광범위한 다른 생물학적 기능에 관여한다.
다른 PtM은 일반적으로 이진 (즉, 단백질은 변형되거나 수정되지 않은 상태로 방치됨)이지만, 유비퀴틴은 단량제 또는 폴리머 체인으로 단백질을 수정할 수 있으며, 부착된 유비퀴틴 자체가 유비퀴티드화된다. 또한, 이러한 폴리비비퀴티닝 체인은 8개의 연계부위5,6중 하나에 부착된 이전 유비퀴틴의 유비퀴티닝을 통해 여러 토폴로지에서 개발할 수 있다. 유비퀴틴은 유비퀴틴의 C-terminus가 7개의 리신 잔기(K06, K11, K27, K29, K33, K48, K48, K63) 또는 이전 유비퀴틴(Mquitin, U63)의 N-터미널(Mquitin) 또는 이전 유비퀴틴(Mquitin) 또는 N-터미널(Mquitin)에 의해 전달된다. 이 사슬 토폴로지는 수정 하에 단백질의 운명에 열쇠입니다. 예를 들어, K48 또는 K11 연결 체인을 사용하여 수정하면 프로테솜에서 변형된 단백질의 분해를 초래하며, NF-kB 시그널링의 활성화를 위해 선형 체인이 필요하다. 따라서, 이러한 사슬 토폴로지의 상대적 분포는 다양한 생물학적 질문과 관련이 있다.
질량 분광법(MS)의 사용은 항체 기반 또는 친화성 기반 상호 작용7,8에의존하지 않기 때문에 유비퀴틴 사슬 토폴로지 분석에 특히 유익하며, 그 중 상당수는 특이성이 제한되어 있으며 다양한 사슬 유형 사이에서 분화하지 않는다. 다른 검출 가능성은 유전자 변형 유비퀴틴 돌연변이를 사용하고 있습니다. 여기서, 특정 리신은 유비퀴틴에 의한 수정을 지원할 수 없는 아르기닌으로 교환된다. 기판 단백질에 유비퀴틴 사슬 형성의 부족은 다음 특정 토폴로지9에대한 증거로 해석된다.
유비퀴티드 단백질의 MS 기반 식별은 유비퀴틴의 C-종물이 MS 분석을 위한 시료의 프로테오리틱 준비 중에 트립신에 의해 인식되는 위치(74)에 아르기닌 잔류물을 함유하고 있으며, C-말단 이중 글리신을 분리한다는 사실에 근거한다. 이 글리글리(-GG)는 기판 단백질의 리신 잔류물의 ε 아미노 그룹에 부착된 채로 남아 있다. 유비퀴틴 토폴로지 분석을 위해, 유비퀴틴의 7개의 리신 잔류물 중 하나에서 수정이 발생합니다. 이것은 GG에 의해 변형되는 리신 잔류물을 운반하는 7개의 키 펩티드 세트를 생성하며, 각 토폴로지(그림2)에특이적으로 변형된다. 예를 들어, K06 토폴로지를 사용하면 아미노산 서열의 위치 6의 리신은 이 리신에 첨가된 114Da의 -GG 변형으로 트립틱 소화로부터 보호됩니다.
MS에 의한 특정 소정의 펩타이드의 식별은 표적 프로테오믹스, 또는 보다 구체적으로, 표적 펩티드획득(10)이라고한다. 사용되는 질량 분광계의 성능에 따라 두 가지 방법이 개발되었습니다. 이들은 선택된 반응 모니터링(SRM), 또한 다중 반응 모니터링(MRM) 및 병렬 반응 모니터링(PRM)이다. SRM은 전구체 m/z 및 제품 이온 m/z로 구성된 전환 선택을 포함합니다. 반대로 PRM은 전구체 m/z만 필요합니다. 포스트 선택, 제품 이온의 전체 측량 스캔이 수행됩니다. 이는측정(11)에앞서 특정 질량 분광계에 대한 수량에 적합한 제품 이온을 선택하지 않는다는 장점이 있다. SRM과 PRM 은 기기에 따라 예약할 수 있습니다. 스케줄링은 펩타이드가 크로마토그래피 시스템에서 정의된 보존 시간에 용례하기 때문에 분석에 특정 이온이 포함되는 시간 창을 할당하는 관행이다. 지정된 시간에 심문되는 이온 수를 줄이면 해당 이온의 심문 빈도가 증가하여 데이터 정확도를 향상시킵니다.
일반적으로, 유비퀴틴 토폴로지대상표적프로테오믹스의 적용은 다른 표적 프로테오믹스 실험과 동일하다. 그러나 두 가지 주요 차이점이 중요합니다: 첫째, 유비퀴틴 체인의 안정성을 고려해야 합니다. 세포 리시스시 사슬을 빠르게 저하시키는 여러 가지 강력한 비쿼터팅 효소(DUBs)가 있습니다. 유비퀴틴 특이적 프로테아제는 티오에스테르아제와 메탈로로테아제의 두 가지 범주로 나뉩니다. 유비퀴틴 하이드로라제의 대부분은 티오스테라아제이며 활성 센터에서 시스테인 잔류물을 운반합니다. 이 시스테인 잔류물을 알킬 수 에 의해, 그들은 비활성화 될 수 있습니다. 이와 같이, N-ethylmaleimide (NEM)와 같은 알킬라팅 에이전트를 포함하는 유비퀴틴 안정화 버퍼의 사용, 고도로 데스팅 화학 물질, 냉각 샘플을 유지하는 것은 성공적인 분석에 필수적이다. 둘째, 다른 표적 실험과 달리 펩타이드 선택은 고정된다. 일반적인 표적 실험에서, 좋은 크로마토그래피 및 이온화 성능을 위해 프로테오티픽 펩티드를 선택할 수 있다. K48과 같은 일부 토폴로지 특성 펩티드의 경우 이러한 특성은 좋으며 다른 제품은 덜 바람직합니다. 예를 들어, 전형적인 역상 설정에서 K33 크로마토그래피는 확장된 용출 프로파일의 형성으로 인해 불량하며, K27 펩티드의 열악한 이온화 특성으로 인해 MS12에의한 가시성을 감소시킵니다.
이 프로토콜에서, 우리는 PRM에 의하여 생물학 견본의 유비퀴틴 토폴로지 평가를 능력을 발휘하는 방법을 기술합니다. 절차에 대한 예 데이터는 여러 상이한 세포 유형에서 MG-132 억제제 치료를 사용하여 프로테좀의 교란을 사용하여 제시된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로테오메 내의 유비퀴틴 상태의 분석은 다양한 생물학적 질문에 대한 중요성을 증가시고 있다. 샘플의 유비쿼터티션 상태에 대한 설명은 단백질의 프로파일뿐만 아니라 이러한 유비쿼터티화의 토폴로지에도 초점을 맞추어야 합니다. 여기에 설명된 바와 같이 표적 MS에 의한 이 토폴로지의 평가는, 생물학 조사의 넓은 범위에 있는 역할이 있습니다.
여기에 설명된 프로토콜…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 대표 결과에 설명된 대로 MG-132의 처리를 가진 세포 펠릿의 창조에 있는 그녀의 도움에 대한 셀린 지티를 감사하고 싶습니다 및 프로토콜에 사용된 E. coli 펠릿의 그녀의 제공을 위한 Elise Mommaerts.
Materials
| Acetonitrile (ACN) | Merck | 100029 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Fluka | 9830 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 16 | |
| Chloroacetamide (CAA) | Sigma | 22790 | |
| Eppendorf LoBind | Eppendorf | 22431081 | |
| Formic acid (FA) | Thermo Fisher Scientific | 85178 | |
| Heavy Peptides | JPT Peptide Technologies | ||
| HPLC | Dionex | Ulitimate 3000 | |
| LC Column | Thermo Fisher Scientific | 160321 | |
| Lys C | Wako | 125-05061 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q-Exactive Plus | |
| N-ethylmaleimide (NEM) | ACROS Organics | 156100050 | |
| Positive Control Chain K48 | Boston Biochem | UC-240 | |
| Positive Control Chain K63 | Boston Biochem | UC-340-100 | |
| Positive Control Chain M1 | Boston Biochem | UC-710B-025 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S5881 | |
| Sonifier | Branson sonifier | SFX 150 | |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigam | T6508 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Thermo Fisher Scientific | 77720 | |
| Trypsin | Promega | V1511A | |
| Urea | Sigma | 51456 | |
| Waters μElution C18 plates | Waters | 186002318 |
References
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