Analisi della catena Ubiquitin mediante monitoraggio parallelo della reazione

La stretta regolazione della funzione e della stabilità proteica è di fondamentale importanza, in quanto sono i principali motori del controllo fenotipico della biologia. La funzione di una proteina è costruita da due componenti: la sua sequenza intrinseca di polipeptidi e qualsiasi modificazione posttraslazionale (PTM). Sono state identificate varie PTM chimiche tra cui glicosilazione, fosforilazione, acetilazione e metilazione¹. Nel 1975, Goldstein et^al. L’ubiquitina è stata trovata importante nella degradazione delle proteine³. Tuttavia, da allora è stato stabilito che la funzione dell’ubiquitina come molecola di segnalazione si estende ben oltre la regolazione della stabilità proteica. La segnalazione dell’ubiquitina è coinvolta in una vasta gamma di altre funzioni biologiche, come la stabilizzazione delle proteine, l’autofagia, il controllo del ciclo cellulare e il traffico^{proteico 4}.

Mentre altre PTM sono generalmente binarie (cioè, la proteina viene modificata o lasciata non modificata) per un dato sito, l’ubiquitina può modificare una proteina sia come monomero che come catena polimerica, con l’ubiquitinazione stessa attaccata. Inoltre, questa catena di poliubiquitinazione può svilupparsi in diverse topologie con l’ubiquitinazione della precedente ubiquitina allegandosi a uno degli otto siti di collegamento^5,6. L’ubiquitina viene trasferita da un processo enzimatico multipasso (Figura 1) in cui il C-terminale dell’ubiquitina è collegato a uno dei suoi sette residui di lisina (K06, K11, K27, K29, K33, K48 o K63) o all’N-terminale dell’ubiquitina precedente (indicato come m1 o ubiquitinazione lineare)^5,6. Questa topologia a catena è la chiave del destino della proteina in fase di modifica. Ad esempio, la modifica con una catena collegata K48 o K11 porta alla degradazione della proteina modificata al proteasome, mentre una catena lineare è necessaria per l’attivazione della segnalazione NF-kB. Pertanto, la distribuzione relativa di queste topologie a catena è rilevante per un’ampia varietà di questioni biologiche.

L’uso della spettrometria di massa (SM) è di particolare beneficio per l’analisi della topologia della catena di ubiquitina in quanto non dipende da interazioni basate su^{anticorpi o affinità 7,8}, molte delle quali hanno una specificità limitata e non distinguono tra i vari tipi di catena. Un’altra possibilità di rilevamento è l’uso di mutanti ubiquitina geneticamente modificati. Qui, una lysina specifica viene scambiata con arginina, che non può supportare la modifica con ubiquitina. La mancanza di formazione di catena di ubiquitina sulla proteina del substrato viene quindi interpretata come prova di una topologia^{specifica 9}.

L’identificazione basata sulla SM delle proteine ubiquitinate si basa sul fatto che il C-terminale dell’ubiquitina contiene un residuo di arginina nella posizione 74 che è riconosciuto dalla trippasina durante la preparazione proteolitica dei campioni per l’analisi MS, separando la doppia glicina C-terminale. Questo GlyGly (-GG) rimane attaccato al ε-ammino del residuo di lisina della proteina del substrato. Per l’analisi della topologia dell’ubiquitina, la modifica avviene su uno dei sette residui di lisina dell’ubiquitina. In questo modo viene creato un insieme di sette peptidi chiave che trasportano un residuo di lisina modificato da GG, specifico per ciascuna delle topologie (Figura 2). Ad esempio, con la topologia K06, la lisina in posizione 6 sulla sequenza amminoacido sarà protetta dalla digestione triptica con una modifica -GG di 114 Da aggiunta a questa lisina.

L’identificazione di peptidi predeterminati specifici da parte della SM è indicata come proteomica mirata, o più specificamente, acquisizione mirata di peptidi¹⁰. Sono stati sviluppati due metodi a seconda delle prestazioni dello spettrometro di massa utilizzato. Questi sono il monitoraggio della reazione selezionata (SRM), chiamato anche monitoraggio della reazione multipla (MRM) e monitoraggio della reazione parallela (PRM). L’SRM comporta la selezione di transizioni costituite dal precursore m/z e dal prodotto ione m/z. Al contrario, il PRM richiede solo il precursore m/z. Dopo la selezione, viene eseguita una scansione completa del sondaggio degli ioni prodotto. Ciò ha il vantaggio che non è necessaria alcuna selezione di ioni di prodotto appropriati per la quantificazione sullo spettrometro di massa specifico prima della misurazione¹¹. Sia SRM che PRM possono, a seconda dello strumento, essere programmati. La programmazione è la pratica di assegnare un lacime temporale durante il quale un particolare ione sarà incluso per l’analisi, poiché i peptidi stanno eluendo in tempi di conservazione definiti dal sistema cromatografico. La riduzione del numero di ioni interrogati in un dato momento aumenta la frequenza di interrogatorio degli ioni programmati in quel momento, migliorando così l’accuratezza dei dati.

In generale, l’applicazione di proteomica mirata per la topologia dell’ubiquitina è la stessa di qualsiasi altro esperimento di proteomica mirato. Tuttavia, due differenze chiave sono importanti: in primo luogo, deve essere considerata la stabilità delle catene di ubiquitina. Ci sono più potenti enzimi deubiquitinanti (DBA) che degradano rapidamente le catene sulla lisi cellulare. Le proteasi ubiquitina-specifiche si suddividono in due categorie: le tioesterasi e le metalloproteasi. La maggior parte delle ubiquitina-idrolasi sono tioesterasi e trasportano un residuo di cisteina nel loro centro attivo. Alchilando questo residuo di cisteina, possono essere inattivati. Come tale, l’uso di tamponi di stabilizzazione dell’ubiquitina contenenti agenti alchilanti, come la N-etilmaleimide (NEM), e sostanze chimiche altamente denaturanti, e mantenere i campioni refrigerati è vitale per un’analisi di successo. In secondo luogo, a differenza di altri esperimenti mirati, la scelta peptidica è fissa. In un tipico esperimento mirato, un peptide proteotipico può essere selezionato per buone prestazioni cromatografiche e ionizzazioni. Per alcuni peptidi caratteristici della topologia come K48 queste proprietà sono buone, mentre per altre sono meno desiderabili. Ad esempio, la cromatografia K33 in una tipica configurazione in fase inversa è scarsa a causa della formazione di un profilo di eluizione allungato e le scarse proprietà di ionizzazione del peptide K27 riducono la sua visibilità di MS¹².

In questo protocollo, descriviamo come eseguire la valutazione della topologia dell’ubiquitina di un campione biologico da parte del PRM. I dati di esempio per la procedura sono presentati utilizzando una perturbazione del proteasome utilizzando il trattamento inibitore MG-132 in diversi tipi di cellule.