Ubiquitin-Kettenanalyse durch Parallelreaktionsüberwachung

Die enge Regulierung der Proteinfunktion und -stabilität ist von größter Bedeutung, da sie wichtige Treiber der phätotypischen Kontrolle der Biologie sind. Die Funktion eines Proteins besteht aus zwei Komponenten: seiner intrinsischen Polypeptidsequenz und allen posttranslationalen Modifikationen (PTMs). Verschiedene chemische PTMs wurden identifiziert, einschließlich Glykosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung und Methylierung¹. 1975 identifizierten Goldstein et al.² ein kleines Protein und nannten es aufgrund seiner allgegenwärtigen Natur Ubiquitin. Ubiquitin erwies sich als wichtig für den Proteinabbau³. Seitdem steht jedoch fest, dass die Funktion von Ubiquitin als Signalmolekül weit über die Regulierung der Proteinstabilität hinausgeht. Ubiquitin Signalisierung ist in einer Vielzahl von anderen biologischen Funktionen beteiligt, wie Proteinstabilisierung, Autophagie, Zellzykluskontrolle, und Proteinhandel⁴.

Während andere PTMs im Allgemeinen binär sind (d. h., das Protein wird modifiziert oder unverändert gelassen) für eine bestimmte Stelle, kann Ubiquitin ein Protein sowohl als Monomer oder als polymere Kette modifizieren, wobei das angefügte Ubiquitin selbst ubiquitiniert ist. Darüber hinaus kann sich diese Polyubiquitinationskette in mehreren Topologien mit der Ubiquitination des vorherigen Ubiquitins entwickeln, das an einer von acht Verknüpfungsstellen^5,6anhängt. Ubiquitin wird durch einen mehrstufigen enzymatischen Prozess übertragen (Abbildung 1), bei dem der C-Terminus von Ubiquitin mit einem seiner sieben Lysinrückstände (K06, K11, K27, K29, K33, K48 oder K63) oder dem N-Terminal des vorherigen Ubiquitins (als M1 oder lineare Ubiquitination bezeichnet)^5,6verbunden ist. Diese Kettentopologie ist der Schlüssel zum Schicksal des Proteins, das verändert wird. Beispielsweise führt die Modifikation mit einer K48 oder K11-Verbindungskette zum Abbau des modifizierten Proteins am Proteasom, während eine lineare Kette für die Aktivierung der NF-kB-Signalisierung notwendig ist. Daher ist die relative Verteilung dieser Kettentopologien für eine Vielzahl biologischer Fragen relevant.

Die Verwendung der Massenspektrometrie (MS) ist von besonderem Nutzen für die Analyse der Ubiquitin-Kettentopologie, da sie nicht auf antikörperbasierte oder affinitätsbasierte Wechselwirkungen^7,8angewiesen ist, von denen viele eine begrenzte Spezifität aufweisen und nicht zwischen den verschiedenen Kettentypen unterscheiden. Eine andere Nachweismöglichkeit besteht darin, genetisch veränderte Ubiquitin-Mutationen zu verwenden. Hier wird ein bestimmtes Lysin gegen Arginin ausgetauscht, das die Modifikation durch Ubiquitin nicht unterstützen kann. Der Mangel an Ubiquitin-Kettenbildung auf dem Substratprotein wird dann als Beweis für eine spezifische Topologie^{interpretiert 9}.

Die MS-basierte Identifizierung ubiquitinierter Proteine basiert auf der Tatsache, dass der C-Terminus von Ubiquitin einen Argininrückstand in Position 74 enthält, der von Trypsin während der proteolytischen Vorbereitung der Proben für die MS-Analyse erkannt wird und das C-terminale Doppelglycin trennt. Dieses GlyGly (-GG) bleibt an der ε-Amino-Gruppe des Lysinrückstands des Substratproteins befestigt. Für die Ubiquitin-Topologie-Analyse erfolgt die Modifikation an einem der sieben Lysinrückstände von Ubiquitin. Dadurch wird ein Satz von sieben Schlüsselpeptiden erstellt, die einen Lysinrückstand tragen, der durch GG modifiziert wird, spezifisch für jede der Topologien (Abbildung 2). Bei der K06-Topologie wird beispielsweise das Lysin an Position 6 der Aminosäuresequenz mit einer -GG-Modifikation von 114 Da, die diesem Lysin zugesetzt wird, vor tryptischer Verdauung geschützt.

Die Identifizierung spezifischer vorbestimmter Peptide durch MS wird als gezielte Proteomik oder genauer gesagt als gezielte Peptidakquise¹⁰bezeichnet. Je nach Leistung des verwendeten Massenspektrometers wurden zwei Methoden entwickelt. Dabei handelt es sich um ausgewählte Reaktionsüberwachung (SRM), auch als Multiple Reaction Monitoring (MRM) und als parallele Reaktionsüberwachung (PRM) bezeichnet. SRM umfasst die Auswahl von Übergängen, die aus dem Vorläufer m/z und dem Produkt ion m/z bestehen. Umgekehrt benötigt PRM nur den Vorläufer m/z. Nach der Auswahl wird ein vollständiger Vermessungscan der Produktionen durchgeführt. Dies hat den Vorteil, dass vor der Messung¹¹keine Auswahl geeigneter Produktionen zur Quantifizierung auf dem spezifischen Massenspektrometer erforderlich ist. Sowohl SRM als auch PRM können je nach Instrument geplant werden. Die Terminplanung ist die Praxis der Zuweisung eines Zeitfensters, in dem ein bestimmtes Ion zur Analyse einbezogen wird, da Peptide zu definierten Retentionszeiten aus dem chromatographischen System eluieren. Die Verringerung der Anzahl der zu einem bestimmten Zeitpunkt verhörten Ionen erhöht die Häufigkeit der Abfrage der zu diesem Zeitpunkt geplanten Ionen und verbessert so die Datengenauigkeit.

Im Allgemeinen ist die Anwendung der gezielten Proteomik für die Ubiquitin-Topologie die gleiche wie bei jedem anderen gezielten Proteomik-Experiment. Zwei wesentliche Unterschiede sind jedoch wichtig: Erstens muss die Stabilität von Ubiquitinketten berücksichtigt werden. Es gibt mehrere potente deubiquitinierende Enzyme (DUBs), die Ketten bei der Zelllyse schnell abbauen. Die ubiquitinspezifischen Proteasen lassen sich in zwei Kategorien einteilen: die Thioesterasen und die Metalloproteasen. Die meisten Der Ubiquitin-Hydrolasen sind Thioesterasen und tragen einen Cystein-Rückstand in ihrem aktiven Zentrum. Durch Alkylierung dieses Cysteinrückstandes können sie inaktiviert werden. Daher ist die Verwendung von Ubiquitin-Stabilisierungspuffern, die Alkylierungsmittel wie N-Ethylmaleimid (NEM) und hochdenaturierende Chemikalien enthalten, und die Kühlung von Proben von entscheidender Bedeutung für eine erfolgreiche Analyse. Zweitens ist die Peptidauswahl im Gegensatz zu anderen gezielten Experimenten fixiert. In einem typischen gezielten Experiment kann ein proteotypisches Peptid für eine gute chromatographische und ionisationsleistung ausgewählt werden. Für einige Topologie-charakteristische Peptide wie K48 sind diese Eigenschaften gut, während sie für andere weniger wünschenswert sind. Beispielsweise ist die K33-Chromatographie in einem typischen Reverse-Phase-Setup aufgrund der Bildung eines gestreckten Elutionsprofils schlecht, und die schlechten Ionisationseigenschaften des K27-Peptids reduzieren seine Sichtbarkeit um MS¹².

In diesem Protokoll beschreiben wir, wie die Ubiquitin-Topologie-Bewertung einer biologischen Probe durch PRM durchgeführt wird. Beispieldaten für das Verfahren werden mit einer Störung des Proteasommittels mittels MG-132-Inhibitorbehandlung in verschiedenen Zelltypen dargestellt.