Análise da cadeia de Ubiquitin por monitoramento de reação paralela

A regulação estreita da função proteica e da estabilidade é de suma importância, pois são os principais impulsionadores do controle fenotípico da biologia. A função de uma proteína é construída a partir de dois componentes: sua sequência intrínseca de polipeptídeos e quaisquer modificações pós-transicionais (PTMs). Vários PTMs químicos foram identificados, incluindo glicosilação, fosforilação, acetilação e metilação¹. Em 1975, Goldstein et al.² identificaram uma pequena proteína e a chamaram de ubiquitina devido à sua natureza onipresente. A ubiquitina foi considerada importante na degradação da proteína³. No entanto, desde então, foi estabelecido que a função da ubiquitina como molécula de sinalização vai muito além da regulação da estabilidade proteica. A sinalização da ubiquitina está envolvida em uma ampla gama de outras funções biológicas, como estabilização de proteínas, autofagia, controle de ciclo celular e tráfico de proteínas⁴.

Enquanto outros PTMs são geralmente binários (ou seja, a proteína é modificada ou deixada não modificada) para um determinado local, a ubiquitina pode modificar uma proteína tanto como monômero ou como uma cadeia polimérica, com a própria ubiquitina ligada. Além disso, esta cadeia de poliugenência pode desenvolver-se em várias topologias com a ubiquização da ubiquitina anterior anexando-se a um dos oito locais de ligação^5,6. A ubiquitina é transferida por um processo enzimático multipreitado (Figura 1)onde o C-terminus da ubiquitina está ligado a um de seus sete resíduos de liseina (K06, K11, K27, K29, K33, K48 ou K63) ou o terminal N da ubiquitina anterior (referido como ubiquização M1 ou linear)^5,6. Esta topologia de cadeia é a chave para o destino da proteína sob modificação. Por exemplo, a modificação com uma cadeia ligada a K48 ou K11 leva à degradação da proteína modificada no proteasome, enquanto uma cadeia linear é necessária para a ativação da sinalização NF-kB. Assim, a distribuição relativa dessas topologias em cadeia é relevante para uma ampla variedade de questões biológicas.

O uso da espectrometria de massa (MS) é de particular benefício para a análise topologia da cadeia de ubiquitina, pois não depende de interações baseadas em anticorpos ou à afinidade^7,8, muitas das quais têm especificidade limitada e não diferenciam entre os vários tipos de cadeia. Uma possibilidade diferente de detecção é usar mutantes de ubiquitina geneticamente modificados. Aqui, uma lise específica é trocada por arginina, que não pode suportar a modificação por ubiquitina. A falta de formação da cadeia de ubiquitina na proteína do substrato é então interpretada como evidência para uma topologia específica⁹.

A identificação baseada em MS de proteínasubiquitinadas baseia-se no fato de que o C-terminus de ubiquitina contém um resíduo de arginina na posição 74 que é reconhecido pela trippsina durante a preparação proteolítica das amostras para análise de MS, separando a glicina dupla terminal C. Este GlyGly (-GG) permanece ligado ao grupo ε-amino do resíduo de liseina da proteína do substrato. Para a análise de topologia da ubiquitina, a modificação ocorre em um dos sete resíduos de ubiqutina. Isso cria um conjunto de sete peptídeos-chave que carregam um resíduo de liseina que é modificado por GG, específico para cada uma das topologias(Figura 2). Por exemplo, com a topologia K06, a lisina na posição 6 na sequência de aminoácidos será protegida da digestão tripptica com uma modificação de -GG de 114 Da adicionada a esta lisina.

A identificação de peptídeos pré-determinados específicos por MS é referida como proteômica direcionada, ou, mais especificamente, aquisição de peptídeos direcionados¹⁰. Dois métodos foram desenvolvidos dependendo do desempenho do espectrômetro de massa que está sendo utilizado. São selecionados monitoramento de reação (SRM), também chamado de monitoramento de reação múltipla (MRM) e monitoramento de reação paralela (PRM). O SRM envolve a seleção de transições constituída pelo precursor m/z e pelo produto íon m/z. Por outro lado, o PRM requer apenas o precursor m/z. Seleção de postes, é realizada uma pesquisa completa dos íons do produto. Isso tem a vantagem de que não é necessária seleção de íons de produtos apropriados para quantitação no espectrômetro de massa específico antes da medição¹¹. Tanto o SRM quanto o PRM podem, dependendo do instrumento, ser agendados. O agendamento é a prática de atribuir uma janela de tempo durante a qual um determinado íon será incluído para análise, pois os peptídeos estão eluvando em tempos de retenção definidos do sistema cromatográfico. Reduzir o número de íons sendo interrogados a qualquer momento aumenta a frequência de interrogatório desses íons programados naquele momento, melhorando assim a precisão dos dados.

Em geral, a aplicação de proteômica direcionada para topologia de ubiquína é a mesma de qualquer outro experimento de proteômica direcionado. No entanto, duas diferenças fundamentais são importantes: primeiro, deve-se considerar a estabilidade das cadeias de ubiquitina. Existem múltiplas enzimas debiquitinadas potentes (DUBs) que rapidamente degradam cadeias sobre a lise celular. As proteases específicas da ubiquitina se enquadram em duas categorias, as tioesterases e metaloproteases. A maioria das hidrolases da ubiquiquitina são tiaesterases e carregam um resíduo de cisteína em seu centro ativo. Ao alquilar este resíduo de cisteína, eles podem ser inativados. Como tal, o uso de tampões de estabilização de ubiquitina contendo agentes alquilantes, como n-ethylmaleimida (NEM), e produtos químicos altamente desnaturados, e manter amostras refrigeradas é vital para uma análise bem sucedida. Em segundo lugar, ao contrário de outros experimentos direcionados, a escolha do peptídeo é fixa. Em um experimento típico direcionado, um peptídeo proteotipado pode ser selecionado para um bom desempenho cromatógrafo e ionização. Para alguns peptídeos característicos da topologia, como o K48, essas propriedades são boas, enquanto para outros, são menos desejáveis. Por exemplo, a cromatografia K33 em uma configuração típica de fase inversa é ruim devido à formação de um perfil de elução esticada, e as propriedades de ionização precárias do peptídeo K27 reduzem sua visibilidade pela MS¹².

Neste protocolo, descrevemos como realizar a avaliação topologia da ubiquitina de uma amostra biológica por PRM. Exemplos de dados para o procedimento são apresentados utilizando uma perturbação do proteasome utilizando tratamento inibidor MG-132 em vários tipos de células diferentes.