ヒト多形核白血球に対する黄色ブドウ球菌の細胞毒性の定量

健康なドナーからのヘパリン化静脈血は、モンタナ州立大学のヒト被験者のための機関審査委員会によって承認されたプロトコルに従って収集されました.すべての寄付者は、この研究に参加することに書面による同意を提供した。 1. ヒト多形核白血球の精製とヒト血清の単離 注:すべての試薬は、市販のエンドトキシン検出キットを使用してエンドトキシンの存在を定期的にチェックする必要があり、PMNの不要なプライミングを防ぐために<25.0 pg/mLエンドトキシンを含める必要があります。 3% デキストラン-0.9% NaCl (w/v)の 50 mL、0.9% NaCl (w/v)の 35 mL、1.8% NaCl (w/v)の 20 mL、1.077 g/mL 密度勾配溶液の 12 mL、および 20 mL の注入または灌漑グレードの水を室温に持ち込みます。 ヒト血清を単離するには、15mLガラス管内の37°Cで抗凝固剤を用いない新鮮に引き出されたヒト血液の4mLを30分間15mLのガラス管でインキュベートする。インキュベーション後、室温で10分間2,000~3,000×gで遠心分離試料を行う。上部血清層を新鮮な15 mL円錐円錐遠心管に移し、氷の上に置きます。 25 mL の新鮮なヘパリン化 (1000 単位/mL) 全ヒト血液を 25 mL の室温 3% デキストラン -0.9% NaCl (1:1 比) で 2 つの反復 50 mL 円錐形遠心管 (チューブあたり 50 mL 総容積) を組み合わせます。各50mL円錐形チューブを穏やかに揺らして混ぜ、30分間室温で放置します。 室温でインキュベーションすると、2つの別々の層が表示されます。各デキストラン血混合物の最上層を新しい50mL円錐管に移し、450 x gで低いまたはブレーキなしで室温で10分間遠心分離機を移す。 慎重に両方の上清を吸引し、細胞ペレットを邪魔することなく廃棄します。室温0.9%NaClの2 mLで各細胞ペレットを穏やかに再懸濁し、再懸濁ペレットを単一の50 mL円錐管に組み合わせ、残りの0.9%NaCl(35mLの最終容積)を加えます。 慎重にハンドピペットを使用して、セル懸濁液の下に1.077 g/mL密度勾配溶液の室温10 mLを下敷き。450 x gでスピンし、ブレーキが低いかブレーキなしで室温で30分間回転します。細胞ペレットを邪魔することなく、上清を穏やかに吸引する。上清は、先に説明した14のように回収できる末梢血単核細胞を含有する。 室温の水の20 mLで細胞ペレットを再サスペンドすることによって赤血球をリスする。30sのためにチューブを揺らして穏やかに混ぜます。赤血球のリンパは濁度の明確な減少を伴うであろう。 直ちに1.8%NaCl(室温[RT])の20 mLを加え、450×gで遠心分離試料を室温で10分間加えます。注:PMNの収率を最大化し、PMNリシスおよび/または活性化を防ぐために、赤血球リシスの後にPMNが単独で水中に残される時間を最小限に抑することが重要です。 細胞ペレットを邪魔することなく、慎重に上清を吸引します。細胞ペレットをRT RPMI 1640培地の2mLで軽く再サスペンドし、氷の上に置きます。 ヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントします。精製されたPMNを氷冷RPMIで1 x 107セル/mLの濃度で再サスペンドし、氷の上に置いておきます。 精製PMN(1 x 106細胞)の100μLと、2つの反復フローサイトメトリーチューブに1μLのヨウ化プロピジウム染色を含む300°Lの氷冷ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を組み合わせます。血漿膜損傷に対する陽性制御を行うには、40μLの0.5%Triton X-100溶液をフローサイトメトリーチューブの1つに加え、十分に混合します。 フローサイトメトリーを使用して、精製細胞の前方散乱、側散乱、およびヨウ化プロピジウム染色(535/617 nmでの励起/発光最大値)を測定します(図1)。注:前方および側面散乱解析は、リンパ球および単球の望ましくない集団を同定する。ヨウ化プロピジウムは、妥協した形質膜を有する細胞を染色し、ヨウ化プロピジウム陽性細胞の集団を顕著にした精製PMNのみを使用すべきではない。これらの研究では、精製PMNは、精製された細胞の>98%とヨウ化プロピジウムに対して<5%染色陽性を含む場合にのみ使用された。 DPBSで希釈した20%単離ヒト血清の100μLでこのアッセイに使用される個々のウェルをコーティングすることにより、PMN細胞傷害性アッセイ用の96ウェルプレートを準備します。メモ:PMNをプラスチックまたはガラスに直接めっきすると、細胞が活性化します。メディアのみを受信する少なくとも 1 つの負のコントロールウェルと、0.05% Triton X-100 を受け取る少なくとも 1 つの正のコントロールウェルを含めてください。 プレートを37°Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、コーティングした井戸を氷冷DPBSで2回洗浄し、余分な血清を除去します。プレートを上下逆さまに軽くタップして、残留DPBSを取り除き、氷の上に置きます。 精製されたヒトPMNを1 x 107セル/mLで100μLをコーティングされた各ウェル(1 x 106 PMN/ウェル)にゆっくりと加えます。PMNが少なくとも5分間氷上のプレートをインキュベートして井戸に沈着することを許可します。 2. ヒト多形核白血球に対するS.アウレウス細胞外タンパク質の細胞毒性アッセイ 培養S.アウレウスは、37°Cに設定された振とうインキュベーターを用いてトリプティック大豆スープ(TSB)で一晩培養する。これらの研究では、別々の150 mLエルレンマイヤーフラスコ中のTSBの20mLを、S.アウレウス株USA300またはUSA300ΔsaeR/Sの凍結培養物で接種し、250rpmで振とうして約14時間成長させた。 サブカルチャー S.アウレウスは、新鮮な媒体を用いて一晩の細菌培養の1:100希釈を行った。細菌が早期の静止成長期に達するまで振とう37°Cでインキュベートする。注:これらの実験では、150mLエルレンマイヤーフラスコ中の20mLのトリプティック大豆ブロスを、一晩培養したUSA300またはUSA300ΔsaeR/Sの200μLで接種し、5時間250rpmで振としながら37°Cでインキュベートした。 細菌が早期の静止成長期に達したら、1mLのサブカルチャー S.aureusを1.5mLマイクロ遠心管に移し、室温で5分間5分間5,000×gで遠心分離機を移す。 遠心分離後、上清を3mLシリンジに転写する。0.22μmフィルターを通して上清を渡し、氷上の新しい1.5 mLマイクロ遠心管に入れます。 S.アウレウスの培養に使用される氷冷媒体を用いて上清の連続希釈を行う。注:示された実験のために、USA300およびUSA300ΔsaeR/Sからの上清は氷冷TSBとの4つの連続した1/2ログ希釈を受けた。 ステップ1.15の氷上のPMNを含む96ウェルプレートの個々のウェルに、上清サンプルまたはメディアのみを(負および正のコントロールの場合)ゆっくりと追加します。これらの実験のために、USA300またはUSA300ΔsaeR/S上清サンプルの10μLを各ウェルに添加した。穏やかにロックプレートは、井戸に上清を配布し、37°でインキュベートします。 希望の時間に、インキュベーターからプレートを取り出し、氷の上に置きます。正のコントロールによく0.5%トリトンX-100の40 μLを加えます。 各ウェルでサンプルをゆっくりと上下にピペットし、プレートに付着したすべてのPMNを完全に取り除き、300μLの氷冷DPBSを含む氷上のサイトメトリーチューブをフローするようにサンプルを移します。 フローサイトメトリーを用いてヨウ化プロピジウム陽性PMNの割合を測定する(図2A)。DNAに結合すると、ヨウ化プロピジウムは535/617 nmで励起/放出を有する。 3. 食細胞症後のヒト多形核白血球に対するS.アウレウス細胞毒性アッセイ 注:600 nm(OD600)の光学密度で定義された成長曲線と細菌の濃度は、このアッセイを開始する前に試験されるS.アウレウス株のために経験的に決定されなければならない。これらの実験の成功は、サブ培養細菌のOD600を使用して中等指数成長期に試験された各S.aureus株の等濃度の一貫した収穫を必要とする。 ステップ2.1.1および2.1.2に記載されているように、S.アウレウス株およびサブカルチャー細菌の一晩培養を開始する。 1mLのマイクロ遠心管に1mLの培養細菌を移し、室温で5分間5,000×gで遠心分離することにより、培養中指数成長に達した場合にサブカルチャー S.アウレウスを収穫した。注:当社の成長条件下では、USA300およびUSA300ΔsaeR/Sは、インキュベーション6の約135分後に中等指数成長期に達しました。 上清を吸引し、ペレット化された細菌をDPBSの1mLに再び沈下し、試料を30sでボルテックスし、室温で5分間5,000×gで遠心分離する。 オプソニゼーションS.アウレウスは、DPBSで希釈した20%ヒト血清の1mLで細菌ペレットを再懸濁し、15分間攪拌で37°Cでインキュベートする。 遠心分離機は室温で5分間5,000 x gで細菌をオプソン化した。上清を吸引して遠心分離した後にS.aureusを洗浄し、ペレット化された細菌を1mL DPBSに再懸濁し、次いで細菌ペレットが完全に分解され、さらに30秒になるまでサンプルをボルテックスする。室温で5分間5,000×gで遠心分離細菌。 1 mL RPMIでオプソニドS.アウレウス株を再懸濁し、細菌ペレットが完全に分解されるまでサンプルをボルテックスし、さらに30sのために氷の上に細菌を置きます。 氷冷RPMIで所望の濃度にオプソニ化S.アウレウス株を希釈する。30sのための渦と氷の上に置きます。 トリプティック大豆寒天に細菌の1:10連続希釈をめっきすることにより、オプソニングS.アウレウスの濃度を確認します。注:このアッセイに使用される細菌の濃度の違いは、その後のPMN形質膜透過性(図3A)に大きな影響を与える可能性があるため、試験された各株の濃度が実験ごとに決定され、株間で同等であることは非常に重要です。 ステップ1.14から氷上の96ウェルプレートのPMNに、各S.aureus株またはRPMI(正と負のコントロールの場合)の100 μL/ウェルをゆっくりと追加します。穏やかに岩板は、井戸にS.アウレウスを配布します。 食細胞症を同期させるのは、プレートを500×gで遠心分離し、4°C15で8分間分間同期させる。遠心分離直後の37°でプレートをインキュベートする(T =0)。 希望の時に、インキュベーターからプレートを取り出し、氷の上に置きます。正のコントロールによく0.5%トリトンX-100の40 μLを加えます。 各ウェルでサンプルをゆっくりと上下にピペットし、プレートに付着したすべてのPMNを完全に取り除き、200μLの氷冷DPBSを含む氷上に細胞測定チューブを流し、ヨウ化プロピジウムを1μLで流します。 ステップ2.9に記載のフローサイトメトリーを用いてヨウ化プロピジウム染色のサンプルを分析する。