Количественная оценка цитотоксичности золотистого стафилококка против полиморфонеклеарных лейкоцитов человека

Гепаринизированная венозная кровь у здоровых доноров была собрана в соответствии с протоколом, утвержденным Институциональным наблюдательным советом по правам человека при Университете штата Монтана. Все доноры дали письменное согласие на участие в этом исследовании. 1. Очищение полиморфонеклических лейкоцитов человека и изоляция сыворотки человека ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты должны регулярно проверяться на наличие эндотоксина с помощью коммерчески доступного эндотоксинного комплекта обнаружения и должны содержать эндотоксины для предотвращения нежелательных грунтовок ПМН. Принесите 50 мл 3% dextran-0.9% NaCl (w/v), 35 мл 0,9% NaCl (w/v), 20 мл 1,8% NaCl (w/v), 12 мл 1,077 г/мл градиента плотности, и 20 мл воды для воды комнатного класса. Чтобы изолировать сыворотку человека, инкубировать 4 мл свеженарисованной человеческой крови без антикоагулянта при 37 градусах Цельсия в стеклянной трубке объемом 15 мл в течение 30 мин. После инкубации, центрифуга образца на 2000-3000 г в течение 10 минут при комнатной температуре. Перенесите верхний слой сыворотки в свежую коническую центрифугу объемом 15 мл и поместите на лед. Комбинат 25 мл свеженарисованной гепаринозированной (1000 единиц/мл) цельной человеческой крови с 25 мл комнатной температуры 3% dextran-0.9% NaCl (1:1 отношение) в двух репликации 50 мл конических центрифуговых труб (50 мл общего объема на трубку). Смешайте, осторожно качая каждую коническую трубку 50 мл, а затем дайте постоять при комнатной температуре в течение 30 минут. После инкубации при комнатной температуре появятся два отдельных слоя. Перенесите верхний слой каждой смеси декекненной крови в новые конические трубки мощностью 50 мл и центрифугу при температуре 450 х г в течение 10 мин при комнатной температуре с низкими тормозами или без них. Тщательно аспирируйте как супернацианты, так и отбрасывайте, не нарушая клеточные гранулы. Аккуратно приостановите каждую клетку гранулв в 2 мл комнатной температуры 0,9% NaCl, объединить повторной гранулы в одной 50 мл конической трубки, а затем добавить оставшиеся 0,9% NaCl (окончательный объем 35 мл). Тщательно подкладка 10 мл комнатной температуры 1,077 г/мл градиента раствора плотности под клеточной подвеской с помощью ручной пипетки. Спин при 450 х г в течение 30 мин при комнатной температуре с низким и без тормозов. Аккуратно аспирируйте супернатант, не нарушая клеточные гранулы. Супернатант будет содержать периферийные моноядерные клетки крови, которые могут быть собраны, как ранее описано14. Выщелачить красные кровяные тельца, приостанавливая клеточные гранулы в 20 мл воды комнатной температуры. Смешайте осторожно, качая трубку в течение 30 с. Лизис красных кровяных телец будет сопровождаться явным снижением мутности. Сразу же добавить 20 мл 1,8% NaCl (при комнатной температуре »RT» и центрифуги образца на 450 й г в течение 10 минут при комнатной температуре.ПРИМЕЧАНИЕ: Важно свести к минимуму время, что PMNs остаются в воде только после красных кровяных клеток лиза для максимизации урожайности PMN и предотвращения PMN lysis и / или активации. Тщательно аспирируйте супернатант, не нарушая клеточные гранулы. Аккуратно приостановите действие клеточной гранулы в 2 мл РТ RPMI 1640 среднего и место на льду. Подсчитайте клетки с помощью гемоситометра. Оттачивайте очищенные ПМН в концентрации 1 х 107 ячеек/мл с ледяным RPMI и держите на льду. Объедините 100 зл очищенных ПМН (1 х 106 ячеек) с 300 злителами фосфатно-буферизированного солей Дульбекко (DPBS), содержащего 1 зл и пятна пропидий йодида в двух промотируемых трубках цитометрии потока. Для положительного контроля за повреждением плазменной мембраны добавьте 40 qL 0,5% растворtriton X-100 в одну из труб цитометрии потока и тщательно перемешайте. Используйте цитометрию потока для измерения переднего рассеяния, бокового рассеяния и окрашивания йодида пропидиума (возбуждение/излучение максима на уровне 535/617 нм) очищенных клеток(рисунок 1).ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ переднего и бокового рассеяния позволит выявить нежелательные популяции лимфоцитов и моноцитов. Пропидий йодид будет только пятно клеток с скомпрометированной плазменной мембраны и очищенных ПМН, которые имеют выраженные популяции пропидий йодид положительных клеток не должны использоваться. Для этих исследований, очищенные PmNs были использованы только в том случае, если они составили йgt;98% очищенных клеток и lt;5% окрашенных положительный для пропидий йодида. Подготовьте 96-колодую пластину для анализов цитотоксичности PMN, покрывая отдельные скважины, которые будут использоваться в этом анализе с 100 зл/л из 20% изолированной человеческой сыворотки, которая была разбавлена DPBS.ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие PMNs непосредственно на пластик или стекло вызовет активацию клеток. Будьте уверены, чтобы включить по крайней мере один отрицательный контроль хорошо, что будет получать только средства массовой информации и по крайней мере один положительный контроль хорошо, что будет получать 0,05% Triton X-100. Инкубировать тарелку при 37 градусах по Цельсию в течение 30 мин. После инкубации, мыть покрытые колодцы дважды с ледяной DPBS, чтобы удалить излишки сыворотки. Аккуратно коснитесь тарелки вверх дном, чтобы удалить все остаточные DPBS и поместите на лед. Аккуратно добавьте 100 л очищенных человеческих ПМН на 1 х 107 ячеек/мл к каждому хорошо покрытому (1 х 106 PMNs/хорошо). Разрешить PMNs поселиться в колодцах, инкубируя пластины на льду, по крайней мере 5 мин. Держите уровень пластины, чтобы равномерное распределение клеток в каждой скважине и оставить на льду, чтобы избежать нежелательной активации PMNs. 2. Анализ цитотоксичности внеклеточных белков S. aureus против полиморфонеклеарных лейкоцитов человека Культура S. aureus на ночь в триптическом соевом бульоне (TSB) с помощью дрожащего инкубатора, установленного при 37 градусах Цельсия. Для этих исследований, 20 мл TSB в отдельных 150 мл Эрленмайер фляги были привиты с замороженными культурами S. aureus штаммов USA300 или USA300saeR /S и выращены примерно за 14 л с тряской при 250 об/мин. Субкультура S. aureus, выполняя 1:100 разбавления ночной бактериальной культуры со свежими средствами массовой информации. Инкубировать при 37 градусах Цельсия с встряхиванием до тех пор, пока бактерии не достигнут ранней стационарной фазы роста.ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих экспериментов, 20 мл триптического соевого бульона в 150 мл Эрленмейер фляги были привиты с 200 л ночь культивируемых USA300 или USA300saeR /S и инкубируется при 37 градусов по Цельсию с тряской при 250 об/мин в течение 5 ч. Когда бактерии достигли ранней стационарной фазы роста, перенос 1 мл субкультуры S. aureus в микроцентрифугную трубку 1,5 мл и центрифугу при температуре 5000 и г в течение 5 мин при комнатной температуре. После центрифугации перенесите супернатант в шприц 3 мл. Пройдите супернатанты через фильтр 0,22 мкм и в новую микроцентрифуговую трубку мощностью 1,5 мл на льду. Выполните серийные разбавления супернационов с ледяными носителями, используемыми для культуры S. aureus.ПРИМЕЧАНИЕ: Для показанных экспериментов, supernatants от США300 и USA300saeR/S прошли 4 последовательных разбавления журнала 1/2 с ice-cold TSB. Аккуратно добавьте образцы супернатанта или носители только (для отрицательного и положительного контроля) в отдельные скважины из 96-колодца пластины, содержащей ПМин на льду со ступени 1.15. Для этих экспериментов, 10 л ИЗ США300 или USA300saeR /S супернатант образцов были добавлены к каждой скважине. Аккуратно каменная пластина для распределения супернациантов в колодцах и инкубации при 37 градусах Цельсия. В нужное время снимите тарелку с инкубатора и поместите на лед. Добавьте 40 qL 0.5% Triton X-100 к положительному управлению хорошо. Аккуратно пипетка образцы вверх и вниз в каждой скважине, чтобы полностью снять все PMNs придерживаются пластины, а затем передать образцы течь цитометрии труб на льду, которые содержат 300 Зл льда DPBS с 1 Л пропидий йодида. Измерьте долю пропидий йодид-положительных ПМН с помощью цитометрии потока(рисунок 2A). При привязке к ДНК, пропидий йодид имеет возбуждение / выброс на 535/617 нм. 3. S. aureus цитотоксичность асссы против человека полиморфонядерных лейкоцитов после фагоцитоза ПРИМЕЧАНИЕ: Кривые роста, определяемые оптической плотностью в 600 нм (OD600) и концентрация бактерий должны быть определены эмпирически для штаммов S. aureus, которые должны быть проверены перед началом этого исследования. Успех этих экспериментов требует последовательного сбора равных концентраций каждого штамма S. aureus, испытанного на среднеэкспоненциальной фазе роста с использованием OD600 субкультурных бактерий. Начните ночные культуры штаммов S. aureus и субкультурных бактерий, описанных в шагах 2.1.1 и 2.1.2. Урожай субкультурный S. aureus, когда он достиг среднего экспоненциального роста путем передачи 1 мл культивированных бактерий в 1,5 мл микроцентрифуговой трубки и центрифугирования на 5000 г в течение 5 минут при комнатной температуре.ПРИМЕЧАНИЕ: В наших условиях роста, USA300 и USA300saeR/S достигли среднеэкспоненциальной фазы роста после примерно 135 мин инкубации6. Вымойте S. aureus после центрифугации, засаживая супернатанта, resuspending гранулированных бактерий в 1 мл DPBS, вихрь образца для 30 с, и центрифугирование на 5000 г в течение 5 мин при комнатной температуре. Опсонизобит S. aureus, переопродлив бактериальные гранулы в 1 мл 20% человеческой сыворотки, разбавленной DPBS и инкубируя при 37 градусах Цельсия с возбуждением в течение 15 мин. Центрифуга опсонизированных бактерий на 5000 х г в течение 5 минут при комнатной температуре. Вымойте S. aureus после центрифугации, успокоив супернатанта, resuspending гранулированных бактерий в 1 мл DPBS, затем вихрь образец, пока бактериальные гранулы полностью разбита на части плюс дополнительные 30 секунд. Бактерии центрифуги при температуре в 5000 г в течение 5 мин при комнатной температуре. Приостановить опсонизированные штаммы S. aureus в 1 мл RPMI, вихрь образца до тех пор, пока бактериальные гранулы полностью разбита на части, а затем еще 30 с. Поместите бактерии на лед. Разбавить опсонизированные S. aureus штаммов до желаемой концентрации с ледяной RPMI. Вихрь за 30 с и место на льду. Подтвердите концентрацию опсонизированного S. aureus путем покрытия 1:10 серийных разбавлений бактерий на триптическом соевом агаре.ПРИМЕЧАНИЕ: Потому что различия в концентрации бактерий, используемых в этом анализе может иметь большое влияние на последующие PMN плазменной мембраны проницаемость(Рисунок 3A), это очень важно, что концентрация каждого штамма испытания определяется для каждого эксперимента и эквивалентно между штаммами. Аккуратно добавьте 100 л/колодец каждого штамма S. aureus или RPMI (для положительного и отрицательного контроля) в PMNs в 96-колодской пластине на льду со ступени 1.14. Аккуратно каменная пластина для распространения S. aureus в колодцах. Синхронизируйте фагоцитоз, центрифугируя пластину на 500 г в течение 8 мин при 4 КК15. Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия сразу после центрифугации (Т 0). В нужное время снимите тарелку с инкубатора и поместите на лед. Добавьте 40 qL 0.5% Triton X-100 к положительному управлению хорошо. Аккуратно пипетка образцы вверх и вниз в каждой скважине, чтобы полностью снять все PMNs придерживаются пластины, а затем передать образцы течь цитометрии труб на льду, содержащем 200 Зл льда DPBS с 1 Л пропидий йодида. Анализ образцов для окоидирования пропидиума йодида с использованием цитометрии потока, как описано в шаге 2.9.