JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

ככמת את רעילות הציטוהילווקיוס האורמית נגד פולימורציטים אנושיות

Published: January 03, 2020
doi:
10.3791/60681
, , , , , , ,
1Department of Microbiology and Immunology,Montana State University, 2University Communications,Montana State University

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה לטיהור של פולימורציטים ברורות מהדם האנושי השלם ושני מוסר שונה כי לכמת את הרעילות של סטייהולוקוקוס האורלנו נגד אלה תאים חיסוניים מולדים חשובים.

Abstract

האורהילוקוקוס הוא מסוגל הפרשה מגוון רחב של leukocidins כי המטרה ולשבש את שלמות הממברנה של פולימורקוציטים ברורה (PMNs או נויטרופילים). פרוטוקול זה מתאר הן את הטיהור של הPMNs האנושי והן את הקוונפיקציה של ה-“רעילות ציטוארה” נגד PMNs בשלושה חלקים שונים. סעיף 1 מפרט את הבידוד של PMNs וסרום מהדם האנושי באמצעות צנטריפוגה צפיפות. מדור 2 בדיקות ציטורעילות של חלבונים החילוץ המיוצר על ידי S. האורלנו נגד אלה PMNs האנושי מטוהרים. סעיף 3 מודד את הרעילות הציטומה נגד האדם PMNs בעקבות phagocyציטוזה של חי S. האוראוס. הליכים אלה למדוד את ההפרעה של פלזמה PMN שלמות קרום על ידי לוקמיה האורמית באמצעות שימוש בניתוח cyPMNs try של מטופלים עם propidium יודיד, כריכת ה-DNA fluorophore כי הוא ממברנה התא הממברנה. באופן קולקטיבי, שיטות אלה יש את היתרון של בדיקות במהירות S רעילות ציטויום של מPMNs האדם העיקרי והוא יכול להיות מותאם בקלות כדי ללמוד היבטים אחרים של אינטראקציות מארח הפתוגן.

Introduction

האורהקוקוס הוא חיידק גראם חיובי הגורם למגוון רחב של מחלות בבני אדם. הפתוגן הבולט הזה מייצר גורמים התקפה אלימה רבים שתורמים להיבטים שונים של זיהום. אלה כוללים מולקולות פני השטח המאפשרים S. האורלנו לדבוק סוגים שונים של רקמת מארח1, חלבונים מוליתיים המפריעים התגובה החיסונית מארח2, ומערך של רעלים מופרש היעד סוגים שונים של תאים מארחים3. בדו ח זה, אנו מתארים שיטה המכיל את הרעילות ציטוציטים של חלבונים המיוצרים על ידי S. האוראוס נגד האדם הPMNs ברורה וליוקוציט (או נויטרופילים), תאים העיקרי של אפקטור של הפונדקאי התגובה החיסונית מולדת.

PMNs הם הלוקוציטים. השופעים ביותר ביונקים אלה תאים חיסוניים מחזורי מגויס במהירות לאתר של עלבון רקמות מארח בתגובה אותות סכנה המיוצר על ידי תאים תושב או על ידי תרכובות ייחודיות הפולשים חיידקים. הקלט מהמולקולות הללו ומאנשי קשר ישירים עם תאים מארחים מופעלים שהופעלו במהלך extravasation להגדיל את מצב ההפעלה של PMNs בתהליך המכונה הטרמה4,5. מPMNs כי הגיעו רקמת מצוקה ולאחר מכן לבצע תגובות החיסונית מולדים חשובים שנועדו למנוע את הקמתה של זיהום. אלה כוללים את הכריכה הפנמה, או phagocyציטוזה, של פולשים מיקרואורגניזמים המפעיל מפל של אירועים תאיים cumulating בהרס חיידק על ידי סוללה של תרכובות מיקרוביאלית חזק5.

PMNs לשחק תפקיד חיוני הגנה על בני אדם מפני הפולשים פתוגנים והם חשובים במיוחד למניעת הזיהום S. האוראוס 4. עם זאת, חיידק זה מייצר מגוון רחב של גנים התקפה אלימה הפוגעים בפונקציות PMN שונים. אלה כוללים חלבונים לחילוץ לחסום את ההכרה של מולקולות איתות, למנוע הדבקה של רקמות מארח, לעכב את הייצור של תרכובות מיקרוביאלית, ולהתפשר על שלמות קרום הפלזמה4. שיעור הביטוי הזמני של הגנים הללו באמצעות הקלט הקולקטיבי ממערכות חישה מרובות של שני רכיבים המכירים ברמזים סביבתיים ספציפיים. Saer/S שני רכיבים מערכת היא הרגולטור העיקרי של S. הנקרא התקפה גנטית שעתוק גנים במהלךזיהום 6,7,8,9,10,11. בפרט, מערכת זו שני רכיבים הוכח להיות קריטי לייצור של לוקמיה דו קומפוננטי המיועד במיוחד לאדם PMNs12.

פרוטוקול זה מחולק לשלושה חלקים שונים. הסעיף הראשון מתאר את הטיהור של PMNs מן הדם האנושי באמצעות הדרגתי צפיפות צנטריפוגה באמצעות פרוטוקול שהותאמה משיטות שנקבעו על ידי Bøyum13 ו Nauseef14. הסעיפים השני והשלישי מפרטים שתי טכניקות שונות כדי לבחון את הרעילות של אס. אחד מהרעיל את PMNs עם חלבונים מסחטות המיוצרים על ידי S. האוראוס בעוד השני בוחן את היכולת של חיידקים חיים לפגוע PMNs בעקבות phagocyציטוזה. הליכים אלה משתמשים propidium יודיד כדי למדוד את ההפסד של השלמות PMN פלזמה הממברנה שנגרמו על ידי S. האורלנו נקבובית-ויוצרים רעלים. Propidium יודיד הוא ה-DNA מחייב fluorophore כי הוא בדרך כלל ממברנה התא האטום אך יכול לחצות ממברנות פלזמה כי שובלו על ידי S. האוראוס רעלים. הניתוח cypropidium try זרימה מאפשר את הקוונפיקציה מהירה של יודידה חיובי PMNs למדוד את הרעילות היחסית של זנים S. האוראוס . סטפילוקוקוס-עמיד S. האוראוס (MRSA) מזוהה כגון אלקטרופורזה-שדות ג’ל סוג USA300 ו המוטציה מחיקה איזוגנית של saer/s במאמץ זה (USA300Δsaer/S) שימשו כמודלים כדי להדגים כיצד הליכים אלה יכולים לכמת את הרעילות של S. האורלנו נגד האדם PMNs.

Protocol

דם הורידים של heparinized מתורמים בריאים נאסף בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי מועצת הסקירה המוסדית לנושאים אנושיים באוניברסיטת מונטנה. כל התורמים סיפקו הסכמה בכתב להשתתף במחקר זה. 1. טיהור הפולימלוציטים האנושיות והבידוד של הנסיוב האנושי הערה: כל הריאגנטים צריך להיבדק באופן שגרתי עבור הנוכחות של אנדוטוקסין באמצעות ערכת זיהוי אנדוטוקסין זמין מסחרית צריך להכיל < 25.0 pg/mL אנדוטוקסין כדי למנוע הטרמה לא רצויה של PMNs. הביאי 50 mL של 3% dextran-0.9% כלים (w/v), 35 mL של 0.9% (w/v), 20 מ ל של 1.8% היום (w/v), 12 מ ל בצפיפות מעבר הצבע g/mL, ו -20 מ ל של מים הזרקה או השקיה בכיתה לטמפרטורת החדר. כדי לבודד את הנסיוב האנושי, הדגירה 4 מ ל של דם אנושי שצויר מבלי נגד מקריש ב 37 ° c בצינור זכוכית של 15 מ ל 30 דקות. לאחר דגירה, דגימת צנטריפוגה בשנת 2000 – 3000 × g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. להעביר את שכבת הסרום העליון לתוך צינור חדש 15 מ”ל של צנטריפוגה ו מקום על הקרח. שילוב 25 מ ל של heparinized טריים (1000 יחידות/mL) דם אנושי שלם עם 25 מ ל של טמפרטורת החדר 3% dextran-0.9% נקול (1:1 יחס) בשני שכפול 50 מנורות צנטריפוגה מ ל (50 mL). מערבבים על ידי נדנדה בעדינות כל 50 מ”ל שפופרת חרוט ולאחר מכן לתת לעמוד בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות. לאחר הדגירה בטמפרטורת החדר, יופיעו שתי שכבות נפרדות. העבר את השכבה העליונה של כל התערובת דם dextran לתוך חדש 50 mL שפופרות חרוט ו צנטריפוגה ב 450 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר עם נמוך או ללא בלמים. מתיף בזהירות את הסופרנטנים ומתעלם מבלי להפריע את כדורי התא. השעיית מחדש בעדינות כל גלולה תא ב-2 מ ל של טמפרטורת החדר 0.9%, לשלב את כדורי מחדש ב-1 50 mL בשפופרת חרוט, ולאחר מכן להוסיף את הנותרים 0.9% כמות (הנפח הסופי של 35 mL). בזהירות לאנדרליי 10 mL של טמפרטורת החדר של 1.077 g/mL צפיפות מעבר הצבע מתחת ההשעיה התא באמצעות פיפטה יד. ספין ב 450 x g עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר עם נמוך או ללא בלמים. מבלי להפריע. לגלולה הסלולרית הסופרנטאנט יכיל תאי דם היקפיים שניתן לאסוף כמתואר בעבר14. לאחר כדוריות הדם האדומות על ידי השעיית מחדש את הגלולה בתא 20 מ ל של מים בטמפרטורת החדר. מערבבים בעדינות על ידי נדנדה הצינור עבור 30 s. הליזה של כדוריות הדם האדומות ילוו בירידה ברורה בעכירות. מיד להוסיף 20 מ ל של 1.8% הנאגל (בטמפרטורת החדר [RT]) ו מדגם צנטריפוגה ב 450 × g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.הערה: חשוב למזער את הזמן שPMNs נותרו במים לבדו בעקבות הפירוק של תא דם אדום כדי למקסם את התשואה של PMN ולמנוע הליזה PMN ו/או הפעלה. מבלי להפריע. לגלולה הסלולרית בעדינות להשעות מחדש את הגלולה התא 2 מ ל של RT RPMI 1640 בינוני ומקום על הקרח. ספירת תאים באמצעות הומוציטומטר. השהה מחדש PMNs מטוהרים בריכוז של 1 x 107 תאים/ML עם RPMI קרח קר ולשמור על קרח. לשלב 100 μL של PMNs מטוהרים (1 x 106 תאים) עם 300 μl של מלוחים באגירה של הקרח הקפוא של Dulbecco (dpbs) המכיל 1 μl של כתם propidium יודיד בשני צינורות שכפול זרימה cy, try. עבור שליטה חיובית נזק קרום הפלזמה, להוסיף 40 μL של 0.5% טריטון X-100 פתרון לתוך אחד הצינורות cy, לנסות לערבב ביסודיות. השתמש cy, למדוד את פיזור הקדמי, הצד פיזור, ו propidium יודיד צביעת (עירור/פליטה מקסימה ב 535/617 nm) של תאים מטוהרים (איור 1).הערה: ניתוח פיזור לפנים ולצדדים יזהה אוכלוסיות לא רצויות של לימפוציטים ומונוציטים. Propidium יודידה יהיה רק להכתים תאים עם קרום פלזמה פרוצים ומטוהרים PMNs כי יש בולטת אוכלוסיות של Propidium התאים החיוביים ביותר לא צריך לשמש. עבור מחקרים אלה, PMNs מטוהרים היו בשימוש רק אם הם מורכבים > 98% של תאים מטוהרים ו < 5% מוכתם חיובי עבור propidium יודיד. להכין צלחת 96-הבאר עבור PMN הרעילות ציטומה על ידי ציפוי בארות בודדות שישמשו בתוך שיטת הפעולה עם 100 μL של 20% סרום אנושי בודד כי כבר מדולל עם DPBS.הערה: ציפוי PMNs ישירות על פלסטיק או זכוכית יגרום הפעלת התאים. הקפד לכלול לפחות שלילי אחד היטב כי יהיה רק לקבל מדיה לפחות שליטה חיובית אחת היטב כי יקבל 0.05% טריטון X-100. מודקת את הצלחת ב 37 ° c עבור 30 דקות. בעקבות דגירה, לשטוף את הבארות מצופה פעמיים עם DPBS קר קרח כדי להסיר את כל הסרום עודף. הקש בעדינות את הצלחת הפוך כדי להסיר DPBS שיורית ומקום על הקרח. בעדינות להוסיף 100 μL של PMNs אנושי מטוהרים ב 1 x 107 תאים/mL לכל מצופה היטב (1 x 106 PMNs/טוב). אפשר PMNs להתיישב בבארות על ידי הפצת הצלחת על הקרח לפחות 5 דקות. לשמור על רמת הצלחת לאפשר אפילו הפצה של תאים בכל באר ולהשאיר על הקרח כדי למנוע הפעלה לא רצויה של PMNs. 2. הסדר של הרעלת ציטוזה של S. האוראוס חלבונים נגד פולימלוציטים ברורים האדם תרבות שנות הלילה בציר סויה טריפטי (TSB) באמצעות אינקובטור רועד הממוקם ב37 ° c. עבור מחקרים אלה, 20 מ ל של TSB בנפרד 150 mL Erlenmeyer מבחנות היו מחוסן עם תרבויות קפואות של S. האוראוס זנים USA300 או USA300ΔSaer/S וגדל עבור כ 14 h עם טלטול ב 250 סל ד. תת-תרבות S. האורלנו על-ידי ביצוע דילול של 1:100 בתרבית חיידקית של לילה עם מדיה טרייה. מודטה ב 37 ° c עם טלטול עד החיידקים להגיע שלב מוקדם הצמיחה נייח.הערה: עבור ניסויים אלה, 20 מ ל של ציר סויה טריפטי ב 150 mL Erlenmeyer מבחנות היו מחוסן עם 200 μL של לילה תרבותי USA300 או USA300ΔSaer/S ו-מודחלת ב 37 ° צ’ עם טלטול ב 250 סל ד עבור 5 h. כאשר החיידקים הגיעו שלב מוקדם הצמיחה נייח, להעביר 1 מ ל של תת תרבותי S. האורלנו לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ו צנטריפוגה ב 5,000 × g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה, להעביר את הסופר לתוך מזרק 3 מ ל. להעביר supernatants באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר לתוך צינור חדש 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה על הקרח. בצעו דידקות סדרתיות של סופרנטנים עם מדיה קרה בקרח המשמש לתרבות ס. האוראוס.הערה: עבור הניסויים המוצגים, סופרנטנים מ USA300 ו USA300ΔSaer/S עברו ארבעה רציפים 1/2 ברציפות יומן עם TSB קר קרח. בעדינות להוסיף דגימות supernatant או מדיה בלבד (עבור פקדים שליליים וחיוביים) על בארות בודדות של 96-צלחת לוחית המכילה PMNs על קרח משלב 1.15. עבור ניסויים אלה, 10 μL של USA300 או USA300ΔSaer/S סופר דגימות נוספו כל טוב. צלחת סלע בעדינות כדי להפיץ סופרנטנים בבארות ובדגירה ב 37 ° c. בזמנים הרצויים, להסיר את הצלחת מן החממה ומקום על הקרח. הוסף 40 μL של 0.5% טריטון X-100 לבקרה חיובית היטב. בעדינות פיפטה את הדגימות למעלה ולמטה בכל באר כדי למשוך לחלוטין את כל PMNs דבקה לצלחת, לאחר מכן להעביר את דגימות כדי להזרים cy, צינורות בקרח המכילים 300 μL של DPBS קרח קר עם 1 μL של propidium יודיד. למדוד את הפרופורציה של propidium יודידה חיובי PMNs באמצעות הזרימה cy try (איור 2א). כאשר מאוגד ל-DNA, propidium יודיד יש עירור/פליטה ב 535/617 nm. 3. S. בעלי הרעלת ציטוזה כנגד פולימלוציטים האדם ברור בעקבות פאיגוציטוזה הערה: עקומות גדילה שהוגדרו על ידי צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD600) וריכוז של חיידקים חייב להיקבע בדרך הכלל עבור זנים S. האורלנו להיבדק לפני תחילת הקביעה. הצלחה של ניסויים אלה דורש את הקציר עקבית של ריכוזים שווים של כל S. הרוב הנבג נבדק בשלב באמצע הצמיחה מעריכית באמצעות OD600 של חיידקים תת-תרבותית. להתחיל תרבויות לילה של זנים האורלנו וחיידקים תת-תרבות כמתואר בשלבים 2.1.1 ו 2.1.2. הקציר משנה של תרבות S. האוראוס כאשר הגיע הצמיחה באמצע מעריכי על ידי העברת 1 מ ל של חיידקים מתורבתים 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה שפופרת תפרידו ב 5,000 × g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.הערה: תחת תנאי הצמיחה שלנו, USA300 ו USA300ΔSaer/S הגיע שלב באמצע הצמיחה מעריכית לאחר כ 135 דקות של דגירה6. שטוף S. האורלנו בעקבות צנטריפוגה על ידי הפחתת הסופרנטאנט, השעיית מחדש את החיידקים הפלטאד ב 1 מ ל של dpbs, vortexing את המדגם עבור 30 S, ו תפרידו ב 5,000 × g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. Opsonize S. האורלנו על ידי מחדש את הגלולה החיידקית ב 1 mL של 20% הנסיוב האנושי מדולל עם dpbs ו דגירה ב 37 ° c עם עצבנות עבור 15 דקות. בקטריה מונקרת צנטריפוגה ב 5,000 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. שטוף S. האורלנו בעקבות צנטריפוגה על ידי הפחתת הסופרנטאנט, השעיית מחדש את החיידקים הפלתד ב-1 ML dpbs, ואז מערבולת המדגם עד הגלולה חיידקי מתפרק לחלוטין ועוד 30 שניות נוספות. בקטריה צנטריפוגה ב 5,000 × g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. השהה את opsonized S. האוראוס זנים ב 1 mL RPMI, מערבולת המדגם עד הגלולה בקטריאלי מתפרק לחלוטין, ולאחר מכן עבור 30 נוספים.. מניחים חיידקים על קרח לדלל את הזנים האוראוס לריכוז הרצוי עם RPMI קר קרח. . מערבולת לשלושים ומקום על הקרח לאשר את הריכוז של האורסונזציה של האוראוס על ידי ציפוי 1:10 מדלל את החיידקים על הטריטיק אגר סויה.הערה: מכיוון שהבדלים בריכוז החיידקים המשמשים באפשרות זו יכולה להיות השפעה מרכזית על חדירות PMN בעקבות הממברנה (איור 3a), חשוב מאוד כי הריכוז של כל זן נבדק נקבע עבור כל ניסוי והוא שווה בין זנים. בעדינות להוסיף 100 μL/ובכן של כל ס. הRPMI הזנים או מאמץ (עבור פקדים חיוביים ושליליים) כדי PMNs בצלחת 96-באר על הקרח משלב 1.14. לוחית הרוק בעדינות כדי לפזר את ס. האורלנו בבארות לסנכרן phagocyציטוזה על ידי תפרידו את הצלחת ב 500 × g עבור 8 דקות ב 4 ° c15. הצלחת דגירה ב 37 ° c מיד לאחר צנטריפוגה (T = 0). בזמנים הרצויים, להסיר צלחת מתוך החממה ומקום על הקרח. הוסף 40 μL של 0.5% טריטון X-100 לבקרה חיובית היטב. בעדינות פיפטה את הדגימות למעלה ולמטה בכל באר כדי למשוך לחלוטין את כל PMNs דבקה לצלחת, ולאחר מכן להעביר את דגימות כדי להזרים cy, צינורות על הקרח המכיל 200 μL של DPBS קרח קר עם 1 μL של propidium יודיד. לנתח דגימות עבור propidium יודיד באמצעות זרימה cy try כפי שמתואר בשלב 2.9.

Representative Results

הדגמנו כיצד ההליכים המתוארים לעיל ניתן להשתמש כדי לכמת באופן יחסי את הרעילות של S. האוראוס נגד PMNs אנושי באמצעות MRSA pfge-סוג USA300 ו המוטציה מחיקה איזוגנית של saer/s בזן זה (USA300Δsaer/S) שנוצר במחקרים קודמים6. PMNs בודד באמצעות ההליכים המתוארים בסעיף 1 של פרוטוקול זה היו מוכתם propidium יודיד ונבדק באמצעות הזרימה cy, לנסות. מגרשים לפנים ולצד שימשו כדי להמחיש זיהום של PMNs מטוהרים על ידי מונוציטים או לימפוציטים (איור 1A, B) ו pmn היושרה נקבע באמצעות propidium יודיד כתמים (איור 1ג). השיטה המתוארת של האדם טיהור PMN יכול בעקביות להניב 0.5 x 107 אל 1 x 108 PMNs כי הם > 98% טהור הם > 95% propidium יודיד שלילי. הרעלת ציטוזה של חלבונים מUSA300 שיוצרו על ידי USA300ΔSaer/S נבדקו נגד מטוהרים PMNs (איור 2) בעקבות ההליכים המתוארים בסעיף 2 של פרוטוקול זה. ניסויים אלה להפגין עלייה תלויה הריכוז propidium יודיד כתמים של מטוהרים PMNs בעקבות 30 דקות של שיכרון עם חלבונים מסחטות המיוצר על ידי USA300 (איור 2ב). מחקרים קודמים הוכיחו כי saer/S שני רכיבים מערכת חשוב ביטוי של מספר דו-מרכיבי לוקמיה רבים שהמטרה האנושית PMNs6,10,11,16. בעזרת הממצאים הקודמים האלה, מעט מאוד propidium יודידה-חיוביים PMNs זוהו לאחר החשיפה לחלבונים לחילוץ המיוצר על ידי USA300ΔSaer/S (איור 2ב). ניסויים נוספים הפגינו עלייה יציבה ביחס של PMNs lysed לאחר שיכרון על ידי חלבונים USA300 מסחטות כי plateaued לאחר כ 30 דקות (איור 2ג). הליזה מינימלית של האדם PMNs היה ציין בכל פעם נקודות לאחר החשיפה לחלבונים מסחטות המיוצר על ידי USA300ΔSaer/S. תוצאות אלה ממחישים את השירות של היישום הזה עבור הקוונפיקציה היחסית של רעילות ציטומה על ידי מסחטות החלבונים של האוראוס נגד PMNs אנושי. בדקנו את USA300 ו USA300ΔSaer/S באמצעות שיטת הרעילות של ה-ציטואוס נגד הPMNs האנושית בעקבות phagocyציטוזה המתוארת בסעיף 3 של פרוטוקול זה (איור 3). להגדיל תלוי ריכוז בפרופורציה של propidium יודיד חיובי PMNs נצפתה 90 דקות לאחר phagocyציטוזה של USA300 (איור 3A). ירידה משמעותית נצפתה ביחס של PMNs כי היו propidium יודיד חיוביבעקבותphagocyציטוזה של USA300Δsaer/s (איור 3A), תמיכה בתוצאות אחרות המציינות את מערכת השני רכיבים saer/s חשוב עבור רעילות ציטואס נגד האדם PMNs (איור 2)7,11. כפי שהוזכר קודם לכן והפגינו באיור 3A, הבדלים בריכוז S. האורארה יש השפעה מובהקת על הליזה pmn בעקבות phagocyציטוזה. ספירה של USA300 ו USA300ΔSaer/S המשמשים בכל הניסויים האלה הראו כי הניגודיות של רעילות ציטובין זנים אלה לא היה בשל הבדלים בריכוז של חיידקים בשימוש (איור 3ב). הממצאים הללו מראים כיצד מערכת הרעילות האורמית של האוראוס נגד האדם PMNs בעקבות phagocyציטוזה ניתן להשתמש כדי להעריך את היכולת של זנים שונים של האוראוס להתפשר על שלמות הקרום פלזמה pmn האדם. איור 1: הזרמת ציטונסה לניתוח של PMNs מטוהרים. זרימה הנציגה cy,לנסותמגרשים של (א) מטוהרים האדם PMNs ו (ב) PMNs כי כבר נגועים בכוונה עם דם היקפי תאים מוננובית. (ג) זרם מייצג cy, ההיסטוגרמה היסטוגרמה הדגמת propidium יודידה מינימלית (< 1%) PMNs מטוהרים (אפור מוצל) לעומת PMNs שטופלו עם 0.05% טריטון X-100 (אדום מוצלל). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: הזרימה cyPMNs try הניתוח של שיכור עם חלבונים מסחטות המיוצר על ידי S. האוראוס. (א) זרם מייצגcy, היסטוגרמה של PMNs מוכתם עם propidium יודיד לאחר 30 דקות של דגירה עם בקרת מדיה (כחול מוצל), מסוננים USA300 supernatant בריכוז הסופי של 1:110 (אפור מוצל), או 0.05% טריטון X-100 (מוצל אדום). (ב) היחס של propidium יודיד חיובי PMNs לאחר 30 דקות של דגירה עם ריכוזים שונים של USA300 או USA300 ∆Saer/S supernatants. (ג) שיעור propidium יודידה חיובית PMNs לאורך זמן אחרי דגירה עם USA300 או USA300 ∆Saer/S supernatant בריכוז הסופי של 1:110. נתונים מוצגים כממוצע ± SEM של לפחות 3 ניסויים נפרדים עם * p ≤ 0.05 ו * * p ≤ 0.005 כפי שנקבע על ידי דו מבחן t-זנבית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: הזרימה cyPMNs try ניתוח של הבאים בעקבות phagocytosis של ס. האוראוס. (א) היחס של propidium יודיד חיובי PMNs 90 דקות לאחר phagocyציטוזה של ריכוזים שונים של USA300 או USA300 ∆Saer/S. (ב) ריכוז של זנים האורתיים בשימוש עבור הניסויים המוצגים בלוח A. Data מוצגים כממוצע ± SEM של 4 ניסויים נפרדים עם * p ≤ 0.01 כפי שנקבע על ידי דו-זנבית מבחן t. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את הטיהור של PMNs מן הדם האנושי ושני מוסר שונות כי השימוש propidium יודיד עבור כימות הרעילות של S. האוראוס נגד אלה תאים חיסוניים מולדים חשובים. ההצלחה של הליכים אלה יהיה תלוי באיכות של PMNs מטוהרים ואת ההכנה המתאימה של S. האוראוס וחלבונים לחילוץ המיוצר על ידי פתוגן זה. לבידוד של PMNs, חשוב למזער את הפעלת PMN במהלך ולאחר הטיהור באמצעות ריאגנטים חינם של זיהום אנדוטוקסין, טיפול ההכנות לתא בעדינות, ושמירה על תאים בטמפרטורה המתאימה. סימנים המציינים הפעלה של PMNs כוללים מקלפת תאים במהלך טיהור וכאשר יותר מ 5% תאים מבודדים כתם חיובי עבור propidium יודיד. בגלל תוחלת החיים הקצרה יחסית של PMNs, תאים אלה חייבים להיות מבודדים דם אנושי נבדק באותו יום. PMNs יתחילו להפגין סימנים של אפופטוזיס ספונטנית אם שמאל על הקרח עבור יותר מ 3 h לאחר הטיהור. כפי שהוזכר קודם לכן, חשוב מאוד כי כל הכנה PMN הוא הוערך בקפידה באמצעות הניתוח cy, לנסות לעבור פיזור הקדמי והצד כמו גם propidium יודידה כתמים כדי להבטיח את הטוהר ואת היושרה של תאים מבודדים.

הביטוי של לוקמיה של המרכיב הדו על ידי S. האוראוס אחראי על רוב בסכנה pmn פלזמה שלמות קרום כי הוא נצפתה באמצעות בחני המתואר בפרוטוקול זה. וריאציה על הביטוי של רעלים אלה והנקבוביות האחרות להרכיב פפטידים, כגון מודולים פנול-מסיסים, בין זנים של s. האורבאוס יפיק הבדלים רעילות ציטוטוקסינים נגד PMNs האדם. סטיות משמעותיות במהלך הצמיחה החוץ-גופית בין זנים s. האורבאוס יהיה גם להשפיע על ביטוי של הנקבוביות ויוצרים רעלים ו בנוסף, היחס של S. האורלנו ל PMNs ב phagocyציטוזה יש השפעה מרכזית על הבאים pmn פלזמה ממברנה חדירות (איור 3a) וניסויים אלה דורשים את הקציר עקבית של ריכוזי שווה של כל S. הזנים האבוניים נבדק בשלב הצמיחה מעריכי באמצעות OD600 של חיידקים תת-תרבותית. בהינתן שיקולים אלה, חשוב מאוד להגדיר עקומות גדילה עבור כל הזנים אשר ייבדקו לפני תחילת הרעילות ציטומה. אנחנו לא ממליצים על שיטות אלה לניתוח של הרעלת ציטוזה של האוראוס עם זנים המוצגים הבדלי צמיחה משמעותיים בתוך מבחנה.

USA300 הוא בודד MRSA מורעלים כי ידוע להיות מאוד ציטוטוקסיים נגד האדם PMNs15 ואובדן saer/S במתח זה מפחית באופן דרמטי שעתוק של רבים דו-component לוקמיה היעד האנושי PMNs6,12, מה שהופך אלה זנים אידיאליים מודלים עבור השוואת הרעילות ציטומי באמצעות בחני תיאר. עם זאת, יש וריאציה גנטית נרחבת בין שונים S. האוראוס מבודד את הפרמטרים המפורטים בפרוטוקולים אלה לא יכול לגרום לשינויים משמעותיים ב רעילות באופן משמעותי של האדם PMNs בעת בדיקת זנים S. האורארה אחרים. התאמת תנאי הגדילה, כרכים של סופרנטונים הוסיף, או יחס של חיידקים כדי PMNs עשוי להידרש להצלחה עם שיטות אלה באמצעות זנים אחרים של הברית.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו היתה נתמכת על ידי U.S. המכונים הלאומיים של מענקי בריאות NIH-1R56AI135039-01A1, 1R56AI135039-01, U54GM115371 כמו גם כספים מתחנת החקלאות של אוניברסיטת מונטנה של המדינה, ומענק הציוד מ מרדוק אמון צדקה .

Materials

0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container Baxter 2B1323Q PMN purification
1.5 mL micro-centrifuge tubes with Snap Caps VWR 89000-044 Used in washing cells
1.8% Sodium Chloride Solution Sigma-Aldrich S5150 PMN purification
12x75mm Culture tubes VWR 60818-430 Used as flow cytometry tubes
20% (w/w) Dextran Sigma-Aldrich D8802 PMN purification
3125 Hand Tally Counter Traceable Products 3125CC For counting cells
50 mL conical centrifuge tubes VWR 89039-656 For dispensing media
Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium FischerScientific 211823 For growing cell cultures
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 3 mL FischerScientific BD 309657 For filtering supernatants
Bright-Line Hemocytometer Sigma-Aldrich Z359629 Cell counting apparatus
DPBS, 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) with calcium and magnesium Corning 21-030-CV Used in washing cells
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare 17-1440-02 PMN purification
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets FischerScientific 13-678-11E For aspirating liquid
Greiner CELLSTAR 96 well plates Millipore Sigma M0687 Plate for holding experimental samples
OMICRON Syringe Filters Omicron Scientific SFPV13R For filtering supernatants
Propidium iodide ThermoFisher Scientific P3566 Membrane impermeable DNA stain
PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks Cole-Parmer EW-34503-24 For growing cell cultures
RPMI 1640, 1X without L-glutamine, phenol red Corning 17-105-CV Used in resuspending cells
Sterile Water for Irrigation, USP Baxter 2F7113 PMN purification
The Pipette Pump Bel-Art Products F37898 For aspirating liquid
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Membrane integrity positive control
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foster, T. J., Geoghegan, J. A., Ganesh, V. K., Höök, M. Adhesion, invasion and evasion: The many functions of the surface proteins of Staphylococcus aureus. Nature Reviews Microbiology. , (2014).
  2. Thammavongsa, V., Kim, H. K., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcal manipulation of host immune responses. Nature Reviews Microbiology. 13 (9), 529-543 (2015).
  3. Otto, M. Staphylococcus aureus toxins. Current Opinion in Microbiology. , (2014).
  4. Guerra, F. E., Borgogna, T. R., Patel, D. M., Sward, E. W., Voyich, J. M. Epic Immune Battles of History: Neutrophils vs. Staphylococcus aureus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, (2017).
  5. Nygaard, T., Malachowa, N., Kobayashi, S. D., DeLeo, F. R. Phagocytes. Management of Infections in the Immunocompromised Host. , 1-25 (2018).
  6. Nygaard, T. K., Pallister, K. B., Ruzevich, P., Griffith, S., Vuong, C., Voyich, J. M. SaeR Binds a Consensus Sequence within Virulence Gene Promoters to Advance USA300 Pathogenesis. The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 241-254 (2010).
  7. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. J Infect Dis. 199 (11), 1698-1706 (2009).
  8. Borgogna, T. R., et al. Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
  9. Guerra, F. E., et al. Staphylococcus aureus SaeR/S-regulated factors reduce human neutrophil reactive oxygen species production. Journal of Leukocyte Biology. 100, 1-6 (2016).
  10. Zurek, O. W., et al. The role of innate immunity in promoting SaeR/S-mediated virulence in Staphylococcus aureus. J Innate Immun. 6 (1), 21-30 (2014).
  11. Nygaard, T. K., et al. Aspartic Acid Residue 51 of SaeR Is Essential for Staphylococcus aureus Virulence. Frontiers in Microbiology. 9, 3085 (2018).
  12. Spaan, A. N., Van Strijp, J. A. G., Torres, V. J. Leukocidins: Staphylococcal bi-component pore-forming toxins find their receptors. Nature Reviews Microbiology. , (2017).
  13. Bøyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory. , (1968).
  14. Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. , (2014).
  15. Voyich, J. M., et al. Insights into mechanisms used by Staphylococcus aureus to avoid destruction by human neutrophils. J Immunol. 175 (6), 3907-3919 (2005).
  16. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. The Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).

Tags

Staphylococcus AureusCytotoxicityPolymorphonuclear LeukocytesPMNsNeutrophilsBi-component LeukotoxinsMembrane IntegrityInnate Immune CellsCentrifugationDensity GradientsHeparinized Whole BloodDextranFicollCell IsolationCell Separation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dankoff, J. G., Pallister, K. B., Guerra, F. E., Parks, A. J., Gorham, K., Mastandrea, S., Voyich, J. M., Nygaard, T. K. Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes. J. Vis. Exp. (155), e60681, doi:10.3791/60681 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image