تحديد كميه السمية الخلوية للسبحيه الذهبية ضد الكريات البيضاء البشرية الاحاديه النواة
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقه لتنقيه الكريات البيضاء من الدم البشري الكامل واثنين من الاختبارات المتميزة التي تحدد كميه الخلايا العنقودية الذهبية ضد هذه الخلية المناعية الفطرية الهامه.
Abstract
المكورات العنقودية الذهبية قادره علي إفراز مجموعه واسعه من الكريات البيضاء التي تستهدف وتعطل سلامه الغشاء من الكريات البيضاء تعدد النوى (pmns أو العدلات). يصف هذا البروتوكول كلا من تنقيه PMNs البشرية والقياس الكمي للخلايا الخلوية s. ضد pmns في ثلاثه أقسام مختلفه. القسم 1 تفاصيل عزل PMNs والمصل من الدم البشري باستخدام كثافة طرد. القسم 2 اختبارات السمية الخلوية للبروتينات خارج الخلية التي تنتجها s. الذهبية ضد هذه السموم البشرية المنقية. ويقيس القسم 3 التسمم بالخلايا ضد pmns البشرية بعد كثرة الكريات الذهبية الحية. تقيس هذه الإجراءات الخلل في سلامه غشاء البلازما PMN بواسطة الكريات البيضاء الذهبية باستخدام تحليل تدفق الخلايا الخلوية من pmns تعامل مع يوديد بروبيديوم ، وهو فلوفيموري الحمض النووي ملزم ان غشاء الخلية غير منفذه. وبشكل جماعي ، فان هذه الأساليب لها ميزه الاختبار السريع للخلايا الذهبية ضد pmns البشرية الاوليه ويمكن تكييفها بسهوله لدراسة جوانب أخرى من التفاعلات بين المضيف والممرض.
Introduction
المكورات العنقودية الذهبية هي بكتيريا ايجابيه الجرام التي تسبب طيفا واسعا من الامراض في البشر. هذا الممرض البارز ينتج العديد من عوامل الضراوة التي تساهم في جوانب مختلفه من العدوى. وتشمل هذه الجزيئات السطحية التي تسمح s. الذهبية للانضمام إلى أنواع مختلفه من الانسجه المضيف1, البروتينات خارج الخلية التي تتداخل مع الاستجابة المناعية المضيف2, ومجموعه من السموم يفرز التي تستهدف أنواع مختلفه من الخلايا المضيفة3. في هذا التقرير ، ونحن وصف الطريقة التي تحدد كميه السمية الخلوية من البروتينات خارج الخلية التي تنتجها s. الذهبية ضد الكريات البيضاء البشرية تعدد النوى (pmns أو العدلات) ، والخلايا المستجيب الاولي للاستجابة المناعية الفطرية المضيف.
PMNs هي الكريات البيضاء الأكثر وفره في الثدييات. يتم تجنيد هذه الخلايا المناعية المتداولة بسرعة في موقع أهانه الانسجه المضيفة ردا علي إشارات الخطر التي تنتجها الخلايا المقيمة أو المركبات الفريدة لغزو الميكروبات. المدخلات خارج الخلية من هذه الجزيئات ومن الاتصالات المباشرة مع تنشيط الخلايا المضيفة المقيمين اثناء تسرب زيادة حاله تنشيط pmns في عمليه تعرف باسم فتيله4,5. تستعد PMNs التي وصلت الانسجه المتعثرة ثم تنفيذ الاستجابات المناعية الفطرية الهامه المصممة لمنع إنشاء العدوى. وتشمل هذه الملزمة والاستيعاب الداخل, أو كثرة, من الكائنات المجهرية الغازية التي تطلق سلسله من الاحداث داخل الخلايا التي تتراكم في الدمار ميكروب بواسطة بطارية من المركبات المضادة للميكروبات قويه5.
PMNs تلعب دورا أساسيا في حماية البشر من العوامل المسببة للامراض الغازية وهي مهمة بشكل خاص لمنع العدوى s. الذهبية4. ومع ذلك ، تنتج هذه البكتيريا مجموعه واسعه من الجينات ضراوة التي تعيق وظائف PMN مختلفه. وتشمل هذه البروتينات خارج الخلية التي تمنع التعرف علي جزيئات الإشارات ، ومنع التصاق الانسجه المضيفة ، وتمنع إنتاج المركبات المضادة للميكروبات ، والمساومة علي سلامه غشاء البلازما4. ينظم s. الذهبية التعبير الزماني لهذه الجينات ضراوة من خلال المدخلات الجماعية من النظم الحسية المكونة من عنصرين التي تعترف العظة البيئية المحددة. و saer/S نظام مكونات اثنين هو الرئيسية الأعلى المنظم لل s. الذهبية النسخ الجيني فيعه خلال العدوى6,7,8,9,10,11. وعلي وجه الخصوص ، تبين ان هذا النظام مكون من عنصرين حاسم لإنتاج الكريات البيضاء ثنائيه المكونات التي تستهدف علي وجه التحديد PMNs الإنسان12.
يتم تقسيم هذا البروتوكول إلى ثلاثه أقسام مختلفه. يصف القسم الأول تنقيه PMNs من الدم البشري باستخدام طرد التدرج الكثافة باستخدام بروتوكول تم تكييفه من الأساليب التي وضعتها Bøyum13 و نوفيف14. القسمين الثاني والثالث بالتفصيل اثنين من التقنيات المختلفة لفحص السمية الخلوية s. ; 1 تسمم PMNs مع البروتينات خارج الخلية التي تنتجها s. الذهبية في حين ان الآخر يفحص قدره البكتيريا الحية علي الاضرار pmns التالية كثرة المحببات. تستخدم هذه الإجراءات يوديد بروبيديوم لقياس فقدان سلامه غشاء البلازما PMN الناجمة عن السموم التي تشكل المسام . يوديد بروبيديوم هو فلوكوفيري ملزمه الحمض النووي الذي هو عاده غشاء الخلية غير نفاذه ولكن يمكن عبر اغشيه البلازما التي تم تعطيلها بواسطة السموم s. الذهبية. تحليل تدفق الخلوي يسمح بالتحديد الكمي السريع لل PMNs بروبيديوم يوديد الايجابيه لقياس السمية الذاتية النسبية لسلالات s. الذهبية. وقد تم التعرف علي المذهب الذهبي المقاوم ميثيسيلين ( جرثومه) الذي تم تحديده بأنه النوع الكهربي لجل الحقل النبضي USA300 ومتحولة الحذف من saer/s في هذه السلالة (USA300Δsaer/s) كنماذج لتوضيح كيف يمكن لهذه الإجراءات ان تحدد كميه السمية الخلوية للخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول تنقيه PMNs من الدم البشري واثنين من الاختبارات المتميزة التي تستخدم يوديد بروبيديوم لقياس السمية الخلوية لل s. الذهبية ضد هذه الخلايا المناعية الفطرية الهامه. سيعتمد نجاح هذه الإجراءات علي نوعيه PMNs المنقية والاعداد المناسب للبروتينات الذهبية وخارج الخلية التي ينتجها هذا الممرض. لعزل PMNs ، من المهم التقليل من التنشيط PMN اثناء وبعد تنقيه باستخدام الكواشف خاليه من التلوث اندوتوكسين ، وعلاج الاستعدادات الخلية بلطف ، والحفاظ علي الخلايا في درجه الحرارة المناسبة. وتشمل العلامات التي تشير إلى تنشيط PMNs كتل من الخلايا اثناء تنقيه وعندما أكثر من 5 ٪ من الخلايا المعزولة وصمه ايجابيه ليوديد بروبيديوم. بسبب فتره الحياة قصيرة نسبيا من PMNs ، يجب ان تكون هذه الخلايا معزولة عن الدم البشري واختبارها في نفس اليوم. وسوف تبدا PMNs لتظهر علامات المبرمج التلقائي إذا تركت علي الجليد لأكثر من 3 ساعات بعد تنقيه. كما ذكر في وقت سابق ، من المهم جدا ان يتم تقييم كل اعداد PMN بعناية باستخدام تحليل التدفق الخلوي للامام ومبعثر الجانب ، فضلا عن تلطيخ بروبيديوم يوديد لضمان نقاء وسلامه الخلايا المعزولة.
التعبير عن الكريات البيضاء ثنائيه المكونات بواسطة s. الذهبية هي المسؤولة عن معظم المساس pmn سلامه غشاء البلازما التي لوحظت باستخدام المقايسات الموصوفة في هذا البروتوكول. الاختلاف في التعبير عن هذه السموم وغيرها من الببتيدات تشكيل المسام ، مثل نمطيه الفينول القابلة للذوبان ، بين سلالات s. الذهبية سوف تنتج الاختلافات في السمية الخلوية ضد pmns البشرية. الانحرافات الكبيرة اثناء النمو في المختبر بين سلالات s. الذهبية سوف تؤثر أيضا علي التعبير عن السموم تشكيل المسام الاضافه إلى ذلك ، فان نسبه s. الذهبية إلى pmns في اختبارات كثرة الكريات له تاثير كبير علي نفاذيه غشاء البلازما pmn اللاحقة (الشكل 3ا) وتتطلب هذه التجارب حصاد متناسقة من تركيزات متساوية من كل السلالات الذهبية اختبارها في مرحله النمو الاسي المتوسط باستخدام OD600 البكتيريا المستزرعة. ونظرا لهذه الاعتبارات ، من المهم جدا تحديد منحنيات النمو لجميع السلالات التي سيتم فحصها قبل البدء في اختبارات التسمم الخلوي. نحن لا ننصح هذه الطرق لتحليل السمية الخلوية s. الذهبية مع سلالات التي تظهر الاختلافات الكبيرة في النمو في المختبر.
USA300 هو عزل جرثومه الخبيثة التي من المعروف ان تكون سامه للغاية ضد الإنسان pmns15 وفقدان saer/S في هذه السلالة يقلل بشكل كبير من النسخ العديد من الكريات البيضاء ثنائيه المكونات التي تستهدف الإنسان pmns6,12, مما يجعل هذه السلالات نماذج مثاليه للمقارنة الخلوية باستخدام المقايسات الموصوفة ومع ذلك ، هناك تباين الجينية واسعه النطاق بين مختلف العزلات s. الذهبية والمعلمات المفصلة في هذه البروتوكولات قد لا يؤدي إلى تغييرات كبيره في السمية الخلوية ضد pmns البشرية عند اختبار سلالات s. الذهبية الأخرى. الخياطة ظروف النمو ، وكميات من supernatants المضافة ، أو نسبه من البكتيريا إلى PMNs قد تكون مطلوبه للنجاح مع هذه الأساليب باستخدام سلالات أخرى من s.الذهبية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية الامريكيه للصحة المنح القومية-1R56AI135039-01A1, 1R56AI135039-01, U54GM115371 فضلا عن الأموال من محطه التجربة الزراعية جامعه ولاية مونتانا, ومنحه المعدات من الثقة الخيرية ميردوك .
Materials
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container | Baxter | 2B1323Q | PMN purification |
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes with Snap Caps | VWR | 89000-044 | Used in washing cells |
| 1.8% Sodium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | S5150 | PMN purification |
| 12x75mm Culture tubes | VWR | 60818-430 | Used as flow cytometry tubes |
| 20% (w/w) Dextran | Sigma-Aldrich | D8802 | PMN purification |
| 3125 Hand Tally Counter | Traceable Products | 3125CC | For counting cells |
| 50 mL conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | For dispensing media |
| Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium | FischerScientific | 211823 | For growing cell cultures |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 3 mL | FischerScientific | BD 309657 | For filtering supernatants |
| Bright-Line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Cell counting apparatus |
| DPBS, 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) with calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | Used in washing cells |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | PMN purification |
| Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets | FischerScientific | 13-678-11E | For aspirating liquid |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Millipore Sigma | M0687 | Plate for holding experimental samples |
| OMICRON Syringe Filters | Omicron Scientific | SFPV13R | For filtering supernatants |
| Propidium iodide | ThermoFisher Scientific | P3566 | Membrane impermeable DNA stain |
| PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks | Cole-Parmer | EW-34503-24 | For growing cell cultures |
| RPMI 1640, 1X without L-glutamine, phenol red | Corning | 17-105-CV | Used in resuspending cells |
| Sterile Water for Irrigation, USP | Baxter | 2F7113 | PMN purification |
| The Pipette Pump | Bel-Art Products | F37898 | For aspirating liquid |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Membrane integrity positive control |
References
- Foster, T. J., Geoghegan, J. A., Ganesh, V. K., Höök, M. Adhesion, invasion and evasion: The many functions of the surface proteins of Staphylococcus aureus. Nature Reviews Microbiology. , (2014).
- Thammavongsa, V., Kim, H. K., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcal manipulation of host immune responses. Nature Reviews Microbiology. 13 (9), 529-543 (2015).
- Otto, M. Staphylococcus aureus toxins. Current Opinion in Microbiology. , (2014).
- Guerra, F. E., Borgogna, T. R., Patel, D. M., Sward, E. W., Voyich, J. M. Epic Immune Battles of History: Neutrophils vs. Staphylococcus aureus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, (2017).
- Nygaard, T., Malachowa, N., Kobayashi, S. D., DeLeo, F. R. Phagocytes. Management of Infections in the Immunocompromised Host. , 1-25 (2018).
- Nygaard, T. K., Pallister, K. B., Ruzevich, P., Griffith, S., Vuong, C., Voyich, J. M. SaeR Binds a Consensus Sequence within Virulence Gene Promoters to Advance USA300 Pathogenesis. The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 241-254 (2010).
- Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. J Infect Dis. 199 (11), 1698-1706 (2009).
- Borgogna, T. R., et al. Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Guerra, F. E., et al. Staphylococcus aureus SaeR/S-regulated factors reduce human neutrophil reactive oxygen species production. Journal of Leukocyte Biology. 100, 1-6 (2016).
- Zurek, O. W., et al. The role of innate immunity in promoting SaeR/S-mediated virulence in Staphylococcus aureus. J Innate Immun. 6 (1), 21-30 (2014).
- Nygaard, T. K., et al. Aspartic Acid Residue 51 of SaeR Is Essential for Staphylococcus aureus Virulence. Frontiers in Microbiology. 9, 3085 (2018).
- Spaan, A. N., Van Strijp, J. A. G., Torres, V. J. Leukocidins: Staphylococcal bi-component pore-forming toxins find their receptors. Nature Reviews Microbiology. , (2017).
- Bøyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory. , (1968).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. , (2014).
- Voyich, J. M., et al. Insights into mechanisms used by Staphylococcus aureus to avoid destruction by human neutrophils. J Immunol. 175 (6), 3907-3919 (2005).
- Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. The Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).
