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Immunology and Infection

In Vivo Aumento da Indução de CélulaS T Reguladoras de Gut-Homing

Published: January 22, 2020
doi:
10.3791/60585
, , , ,
1Division of Regenerative Medicine, Department of Medicine,Loma Linda University, 2Zhengzhou University, 3Department of Veterinary Biomedical Sciences, College of Veterinary Medicine,Long Island University, 4Jinan Infectious Disease Hospital,Shandong University

Summary

Aqui apresentamos um protocolo para o aumento in vivo da ininvitro-homing indução de células T regulamentares. Neste protocolo, as células dendríticas são projetadas para produzir localmente altas concentrações da vitamina D ativa (1,25-dihidroxivitamina D ou 1,25[OH]2D) e a vitamina A ativa (ácido retinoico ou AR) de novo.

Abstract

A doença inflamatória intestinal (DII) é uma doença crônica inflamatória no trato gastrointestinal (INTESTINO). Nos Estados Unidos, há aproximadamente 1,4 milhão de pacientes com DII. É geralmente aceito que uma resposta imune desregulada às bactérias do intestino inicia a doença e interrompe a barreira epiteliais mucosa. Recentemente, mostramos que as células reguladoras t (Treg) são uma terapia promissora para a DII. Assim, este artigo apresenta um protocolo para o aumento in vivo da indução da pilha de Treg gut-homing. Neste protocolo, as células dendríticas são projetadas para produzir concentrações localmente altas de duas moléculas de novo, vitamina D ativa (1,25-dihidroxivitamina D ou 1,25[OH]2D) e vitamina a-ida ativa (ácido retinóico ou RA). Escolhemos 1,25 (OH)2D e AR com base em descobertas anteriores mostrando que 1,25 (OH)2D pode induzir a expressão de moléculas reguladoras (por exemplo, caixa de cabeça de garfo P3 e interleucina-10) e que a RA pode estimular a expressão de receptores de homing intestinal nas células T. Para gerar tais células dendríticas projetadas, usamos um vetor lentiviral para transduzir células dendríticas para expressar demais dois genes. Um gene é a família Cytochrome P450 27 membro da subfamília B 1 que codifica 25-hidroxivitamina D 1α-hidroxilase, que fisiologicamente catalisa a síntese de 1,25 (OH)2D. O outro gene é o aldeído dehidrogenase 1 membro da família A2 que codifica retinaldeído dehidrogenase 2, que fisiologicamente catalisa a síntese de AR. Este protocolo pode ser usado para a investigação futura de células Treg gut-homing in vivo.

Introduction

A doença inflamatória intestinal (DII) é uma doença crônica inflamatória no trato gastrointestinal (INTESTINO). Nos Estados Unidos, há aproximadamente 1,4 milhão de pacientes com DII. É geralmente aceito que uma resposta imune desregulada às bactérias do intestino inicia a doença e interrompe a barreira epiteliais mucosa1,2. Por esta razão, atualmente disponíveis E.U. Food and Drug Administration (FDA) medicamentos aprovados inibem as funções dos mediadores inflamatórios ou bloquear o homing de células imunes no intestino. No entanto, os mediadores inflamatórios e células imunes que são alvo também são necessários para defesas imunológicas. Como resultado, os inibidores do mediador inflamatório comprometem a defesa imunológica sistêmica e os bloqueadores de homing de células imunes enfraquecem a defesa imunológica do intestino, ambos os quais podem levar a graves conseqüências3,4. Além disso, os bloqueadores de homing de células imunes também podem bloquear o homing de células reguladoras T (Treg) no intestino e, portanto, pode piorar a tolerância imune do intestino já comprometida em pacientes com DII. Além disso, o bloqueio de células Treg homing no intestino também pode levar à supressão imunológica sistêmica devido ao acúmulo de células Treg no sangue5. Finalmente, inibidores e bloqueadores funcionam de forma transitória e, assim, exigem administrações frequentes. A administração freqüente desses inibidores e bloqueadores pode exacerbar ainda mais os efeitos colaterais desagradáveis.

Recentemente, propusemos uma nova estratégia que pode potencialmente mitigar ou até mesmo eliminar os efeitos colaterais associados com medicamentos atuais para o tratamento de DII6. Esta estratégia aumenta a indução de células Treg gut-homing em tecidos linfóides periféricos6. A lógica desta estratégia é que as células Treg gut-homing especificamente lar do intestino e, portanto, não irá comprometer as defesas imunológicas sistêmicas. Além disso, uma vez que as células Treg podem potencialmente formar memória7,8,células Treg gut-homing pode potencialmente fornecer um controle estável da inflamação crônica do intestino em pacientes com DII e, assim, o tratamento não deve precisar ser administrado com tanta freqüência. Além disso, uma vez que esta estratégia aumenta a indução de células Treg gut-homing in vivo, não tem a preocupação de instabilidade in vivo em um ambiente altamente pró-inflamatório que está associado com a transferência adotiva de células Treg geradas in vitro9,10. A este respeito, as células Treg in vitro geradas são uma das estratégias propostas para o tratamento de doenças autoimunes11,12,13 e rejeição de transplante14,15. Finalmente, nesta estratégia, as células dendríticas (DCs) são projetadas para produzir concentrações localmente altas de duas moléculas de novo: vitamina D ativa (1,25-dihydroxyvitamin D ou 1,25[OH]2D) e vitamina ativa A (ácido retinoico ou RA). Escolhemos 1,25 (OH)2D e RA porque 1,25 (OH)2D pode induzir a expressão de moléculas reguladoras (por exemplo, caixa de cabeceira P3 [foxp3] e interleucina-10 [IL-10])16,17 e que a RA pode estimular a expressão de receptores de homing intestinal em células T18. Porque ambos 1,25 (OH)2D e RA também podem tolerizar DCs28,29, razão que os DCs projetados serão mantidos de forma evigorada em um status tolerogênico in vivo e,portanto,contornar as preocupações de instabilidade in vivo que estão associados com DCs tolerogenic in vitro gerados (TolDCs)19,20,21. A este respeito, toldcs também são uma das estratégias propostas para in vivo aumento das funções celulares Treg19,20,21. Para apoiar o nosso raciocínio, mostramos que os DCs projetados, após a entrega in vivo, podem aumentar a indução de células Treg de calagem intestinal em tecidos linfóides periféricos6.

Uma vantagem adicional de nossa estratégia proposta é que 1,25 (OH)2D também tem outras funções que podem beneficiar potencialmente pacientes com DII. Essas outras funções incluem a capacidade de 1,25 (OH)2D para estimular a secreção de antimicrobianos22 e suprimir a carcinogênese23. Infecções e cânceres são freqüentemente associados à DII24,25.

Para gerar os DCs que podem produzir concentrações localmente altas de 1,25 (OH)2D e RA de novo, usamos um vetor lentiviral para projetar DCs para expressar demais dois genes. Um gene é a família Cytochrome P450 27 membro da subfamília B 1 (CYP27B1) que codifica 25-hidroxivitamina D 1α-hidroxilase (1α-hidroxilase), que catalisa fisiologicamente a síntese de 1,25 (OH)2D. O outro gene é o aldeído dehidrogenase 1 membro da família A2 (ALDH1a2) que codifica retinaldeído dehidrogenase 2 (RALDH2), que fisiologicamente catalisa a síntese de RA6.

Como o aumento in vivo da inin vivo de indução de células Treg de homing intestinal é potencialmente importante no tratamento da DII, no seguinte protocolo, detalharemos os procedimentos para a geração das DCs de 1α-hidroxilase-RALDH2 (células DC-CYP-ALDH) que pode ser usado para a investigação futura de células Treg gut-homing in vivo.

Protocol

Todos os protocolos in vivo de estudo animal foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Loma Linda (IACUC), bem como pelo Animal Care and Use Review Office (ACURO) do Comando de Pesquisa médica e Material do Exército dos EUA (USAMRMC) do Departamento de Defesa. 1. Preparação do Lentivirus que expressa 1α-hydroxylase e RALDH2 (vírus lenti-CYP-ALDH) Dia 0: No início da manhã, prepare 5 x 105 células/mL de c…

Representative Results

As células DC-CYP-ALDH expressaram um aumento significativo na quantidade de 1α-hidroxilase. Para determinar se as células DC-CYP-ALDH geradas a partir de BMDCs expressaram um aumento significativo da quantidade de 1α-hidroxilase, os BMDCs foram transinduzidos com o vírus lenti-CYP-ALDH para produzir células DC-CYP-ALDH derivadas de medula óssea (células BMDC-CYP-ALDH). Posteriormente, as células BMDC-CYP-ALDH foram examinadas para a expressão de 1α-hidroxilase pela FACS. Nossos dados mostrara…

Discussion

Neste artigo descrevemos o uso de células DC-CYP-ALDH, para aumentar a indução de células Treg de calagem intestinal em tecidos linfóides periféricos. Nossos dados mostraram que as células DC-CYP-ALDH podem sintetizar concentrações localmente altas de novo de 1,25 (OH)2D e AR in vitro na presença de substratos correspondentes (ou seja, 25[OH]D e retinol, respectivamente). Porque concentrações sanguíneas suficientes de 25 (OH) D e retinol podem ser facilmente alcançadas através de suplementaçõe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Escritório do Secretário Adjunto de Defesa para Assuntos de Saúde através do Peer Reviewed Medical Research Program no âmbito do Prêmio No. W81XWH-15-1-0240 (XT). Opiniões, interpretações, conclusões e recomendações são as do autor e não são necessariamente endossadas pelo Departamento de Defesa. Este trabalho também foi parcialmente apoiado por Bolsas de Inovação em Pesquisa do Departamento de Medicina da Universidade de Loma Linda (681207-2967 [XT e GG], 681205-2967 [XT], e 325491 [DJB]).

Materials

10 mL syringes ThermoFisher Scientific Cat# 03-377-23
100 mm x 20 mm culture dishes Sigma-Aldrich Cat# CLS430167
12-well culture plates ThermoFisher Scientific Cat# 07-200-82
150 mm x 25 mm culture dishes Sigma-Aldrich Cat# CLS430559
25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) Sigma-Aldrich Cat# H4014
293T cells ATCC CRL-3216
2-mercaptoethanol ThermoFisher Scientific Cat#: 21985023
6-well culture plates ThermoFisher Scientific Cat# 07-200-83
ALDEFLUOR kit Stemcell Technologies Cat# 01700
Anti-CYP27B1 Abcam Cat# ab95047
BD FACSAria II BD Biosciences N/A
CaCl2 Sigma-Aldrich Cat# C1016
CM-10-D cell culture medium DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.
CM-10-R cell culture medium RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.
CM-4-D cell culture medium DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.
Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL Sigma-Aldrich Cat# CLS430513
Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL Sigma-Aldrich Cat# CLS430514
Dissecting scissor ThermoFisher Scientific Cat# 08-940
DMEM medium ThermoFisher Scientific Cat# 11960044
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific Cat# 16000044
Forceps ThermoFisher Scientific Cat# 22-327379
Gibco ACK lysing buffer ThermoFisher Scientific Cat# A1049201
Glycerol Sigma-Aldrich Cat# G5516
Goat anti-rabbit IgG Abcam Cat# ab205718
HEPES Millipore Cat# 391340
Lenti-CYP-ALDH Custom-made 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter.
L-glutamine ThermoFisher Scientific Cat#25030081
Lipopolysaccharide Sigma-Aldrich Cat# L3755
Murine GM-CSF Peprotech Cat# 315-03
Murine IL-4 Peprotech Cat# 214-14
Na2HPO4 Sigma-Aldrich Cat# NIST2186II
NaCl Sigma-Aldrich Cat# S9888
Needles ThermoFisher Scientific Cat# 14-841-02
Nonessential Amino Acids ThermoFisher Scientific Cat#: 11140076
pCMVR8.74 Addgene Plasmid# 22036
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher Scientific Cat#15140148
Phoshate Balanced Solution (PBS) ThermoFisher Scientific Cat#: 20012027
PMD2G Addgene Plasmid# 12259
Polypropylene tube, 15 mL ThermoFisher Scientific Cat# AM12500
Polypropylene tube, 50 mL ThermoFisher Scientific Cat# AM12502
Protamine sulfate Sigma-Aldrich Cat# P3369
Rabbit polycloncal IgG isotype control Abcam Cat# ab171870
Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement Heartland Assays
RPMI 1640 medium, no glutamine ThermoFisher Scientific Cat# 21870076
Sodium pyruvat ThermoFisher Scientific Cat#: 11360070
Sorvall Legend XTR Centrifuge ThermoFisher Scientific Cat# 75004521
Sterile Cell strainers, 40 mm ThermoFisher Scientific Cat# 07-201-430
Sterile storage bottles, 500 mL ThermoFisher Scientific Cat# CLS431432
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References

  1. Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. New England Journal of Medicine. 361 (21), 2066-2078 (2009).
  2. Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual Reviews in Immunology. 28, 573-621 (2010).
  3. Clifford, D. B., et al. Natalizumab-associated progressive multifocal leukoencephalopathy in patients with multiple sclerosis: lessons from 28 cases. Lancet Neurology. 9 (4), 438-446 (2010).
  4. Linda, H., et al. Progressive multifocal leukoencephalopathy after natalizumab monotherapy. New England Journal of Medicine. 361 (11), 1081-1087 (2009).
  5. Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
  6. Xu, Y., et al. In Vivo Generation of Gut-Homing Regulatory T Cells for the Suppression of Colitis. Journal of Immunology. 202 (12), 3447-3457 (2019).
  7. Rosenblum, M. D., Way, S. S., Abbas, A. K. Regulatory T cell memory. Nature Reviews Immunology. 16 (2), 90-101 (2016).
  8. Grimm, A. J., Kontos, S., Diaceri, G., Quaglia-Thermes, X., Hubbell, J. A. Memory of tolerance and induction of regulatory T cells by erythrocyte-targeted antigens. Science Report. 5, 15907 (2015).
  9. Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350 (6258), 334-339 (2015).
  10. Bhela, S., et al. The Plasticity and Stability of Regulatory T Cells during Viral-Induced Inflammatory Lesions. Journal of Immunology. 199 (4), 1342-1352 (2017).
  11. Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Translational Medicine. 7 (315), (2015).
  12. Marek-Trzonkowska, N., et al. Therapy of type 1 diabetes with CD4(+)CD25(high)CD127-regulatory T cells prolongs survival of pancreatic islets – results of one year follow-up. Clinical Immunology. 153 (1), 23-30 (2014).
  13. Desreumaux, P., et al. Safety and efficacy of antigen-specific regulatory T-cell therapy for patients with refractory Crohn’s disease. Gastroenterology. 143 (5), 1201-1202 (2012).
  14. Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117 (14), 3921-3928 (2011).
  15. Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117 (3), 1061-1070 (2011).
  16. Kang, S. W., et al. 1,25-Dihyroxyvitamin D3 promotes FOXP3 expression via binding to vitamin D response elements in its conserved noncoding sequence region. Journal of Immunology. 188 (11), 5276-5282 (2012).
  17. Correale, J., Ysrraelit, M. C., Gaitan, M. I. Immunomodulatory effects of Vitamin D in multiple sclerosis. Brain. 132, 1146-1160 (2009).
  18. Iwata, M., et al. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).
  19. Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
  20. Vicente-Suarez, I., Brayer, J., Villagra, A., Cheng, F., Sotomayor, E. M. TLR5 ligation by flagellin converts tolerogenic dendritic cells into activating antigen-presenting cells that preferentially induce T-helper 1 responses. Immunology Letters. 125 (2), 114-118 (2009).
  21. Danova, K., et al. NF-kappaB, p38 MAPK, ERK1/2, mTOR, STAT3 and increased glycolysis regulate stability of paricalcitol/dexamethasone-generated tolerogenic dendritic cells in the inflammatory environment. Oncotarget. 6 (16), 14123-14138 (2015).
  22. Liu, P. T., et al. Toll-like receptor triggering of a vitamin D-mediated human antimicrobial response. Science. 311 (5768), 1770-1773 (2006).
  23. Cao, H., et al. Application of vitamin D and vitamin D analogs in acute myelogenous leukemia. Experimental Hematology. 50, 1-12 (2017).
  24. Anderson, A., et al. Lasting Impact of Clostridium difficile Infection in Inflammatory Bowel Disease: A Propensity Score Matched Analysis. Inflammatory Bowel Disease. 23 (12), 2180-2188 (2017).
  25. Tsai, J. H., et al. Association of Aneuploidy and Flat Dysplasia With Development of High-Grade Dysplasia or Colorectal Cancer in Patients With Inflammatory Bowel Disease. Gastroenterology. 153 (6), 1492-1495 (2017).
  26. Lee, H. W., et al. Tracking of dendritic cell migration into lymph nodes using molecular imaging with sodium iodide symporter and enhanced firefly luciferase genes. Science Reports. 5, 9865 (2015).
  27. Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. Journal of Immunology. 158 (6), 2723-2730 (1997).
  28. Okada, N., et al. Administration route-dependent vaccine efficiency of murine dendritic cells pulsed with antigens. British Journal of Cancer. 84 (11), 1564-1570 (2001).
  29. Li, C. H., et al. Dendritic cells, engineered to overexpress 25-hydroxyvitamin D 1alpha-hydroxylase and pulsed with a myelin antigen, provide myelin-specific suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis. FASEB J. , (2017).
  30. Narula, N., et al. Impact of High-Dose Vitamin D3 Supplementation in Patients with Crohn’s Disease in Remission: A Pilot Randomized Double-Blind Controlled Study. Digestive Disease Science. 62 (2), 448-455 (2017).
  31. Ahmad, S. M., et al. Vitamin A Supplementation during Pregnancy Enhances Pandemic H1N1 Vaccine Response in Mothers, but Enhancement of Transplacental Antibody Transfer May Depend on When Mothers Are Vaccinated during Pregnancy. Journal of Nutrition. 148 (12), 1968-1975 (2018).
  32. Noronha, S. M. R., et al. Aldefluor protocol to sort keratinocytes stem cells from skin. Acta Cirurgica Brasileira. 32 (11), 984-994 (2017).
  33. Ferreira, G. B., et al. Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways. Cell Reports. 10 (5), 711-725 (2015).
  34. Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells. Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).

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