In Vivo Augmentazione dell'induzione delle cellule T regolatorie Gut-Homing

La malattia infiammatoria intestinale (IBD) è una malattia cronica infiammatoria nel tratto gastrointestinale (GUT). Negli Stati Uniti, ci sono circa 1,4 milioni di pazienti con IBD. È generalmente accettato che una risposta immunitaria disregolata ai batteri intestinali avvia la malattia e interrompe la barriera epiteliale^{mucosale 1,2}. Per questo motivo, attualmente disponibili farmaci approvati U.S. Food and Drug Administration (FDA) inibiscono le funzioni dei mediatori infiammatori o bloccano l’homing delle cellule immunitarie nell’intestino. Tuttavia, i mediatori infiammatori e le cellule immunitarie che sono mirati sono necessari anche per le difese immunitarie. Di conseguenza, gli inibitori del mediatore infiammatorio compromettono la difesa immunitaria sistemica e i bloccanti dell’homing delle cellule immunitarie indeboliscono la difesa immunitaria intestinale, entrambe le quali possono portare a gravi conseguenze^3,4. Inoltre, gli bloccanti delle cellule immunitarie possono anche bloccare l’homing delle cellule T (Treg) regolatorie nell’intestino e quindi possono peggiorare la tolleranza immunitaria intestinale già compromessa nei pazienti affetti da IBD. Inoltre, il blocco delle cellule di Treg homing nell’intestino può anche portare alla soppressione immunitaria sistemica a causa dell’accumulo di cellule Treg nel sangue⁵. Infine, gli inibitori e i bloccanti funzionano in modo transitorio e, di conseguenza, richiedono amministrazioni frequenti. La frequente somministrazione di questi inibitori e bloccanti può esacerbare ulteriormente gli effetti collaterali spiacevoli.

Recentemente, abbiamo proposto una nuova strategia che può potenzialmente mitigare o addirittura eliminare gli effetti collaterali associati ai farmaci attuali per il trattamento Con IBD⁶. Questa strategia aumenta l’induzione delle cellule Treg gut-homing nei tessuti linfoidi periferici⁶. La logica di questa strategia è che le cellule Treg gut-homing specificamente casa per l’intestino e quindi non compromettere le difese immunitarie sistemiche. Inoltre, poiché le cellule Treg possono potenzialmente formare memoria^7,8, cellule Treg gut-homing possono potenzialmente fornire un controllo stabile dell’infiammazione cronica dell’intestino nei pazienti Con IBD e, quindi, il trattamento non dovrebbe essere somministrato con la stessa frequenza. Inoltre, poiché questa strategia aumenta l’induzione delle cellule Treg gut-homing in vivo, non ha la preoccupazione di instabilità in vivo in un ambiente altamente proinfiammatorio che è associato con il trasferimento adottivo di cellule Treg generate in vitro^9,10. A questo proposito, le cellule Treg generate in vitro sono una delle strategie proposte per il trattamento delle malattie autoimmuni^11,12,13 e rigetto del trapianto^14,15. Infine, in questa strategia, le cellule dendritiche (DC) sono progettate per produrre concentrazioni localmente elevate di due molecole de novo: vitamina D attiva (1,25-dihydroxyvitamin D o 1,25[OH]₂D) e vitamina A attiva (acido retinoico o RA). Abbiamo scelto 1,25(OH)₂D e RA perché 1,25(OH)₂D possono indurre l’espressione di molecole regolatorie (ad esempio, forchetta box P3 [foxp3] e interleutra-10 [IL-10])^16,17 e che l’AR può stimolare l’espressione dei recettori gut-homing nelle cellule T¹⁸. Poiché sia 1,25(OH)₂D che RA possono anche tollerare i controller di dominio^28,29, ragioniamo che i controller di dominio ingegnerizzati saranno mantenuti stabilmente in uno stato tolerogenico in vivo e quindi eludere le preoccupazioni inpresentisti che sono associate con DC tolerogeni generati in vitro (TolDC)^19,20,21. A questo proposito, i TolDC sono anche una delle strategie proposte per l’aumento in vivo delle funzioni cellulari Treg^19,20,21. Per sostenere il nostro ragionamento, abbiamo dimostrato che i CONTROLLER di dominio ingegnerizzati, al momento della consegna in vivo, possono aumentare l’induzione delle cellule Treg gut-homing nei tessuti linfoidi periferici⁶.

Un ulteriore vantaggio della nostra strategia proposta è che 1,25(OH)₂D ha anche altre funzioni che possono potenzialmente beneficiare i pazienti con IBD. Queste altre funzioni includono la capacità di 1,25(OH)₂D per stimolare la secrezione di antimicrobici²² e per sopprimere la carcinogenesi²³. Infezioni e tumori sono spesso associati con IBD^24,25.

Per generare i CONTROLLER di dominio in grado di produrre concentrazioni locali elevate sia di 1,25(OH)₂D che di RA de novo, utilizziamo un vettore lentivirale per progettare dc per sovraesprimere due geni. Un gene è il citocromo P450 famiglia 27 sottofamiglia B membro 1 (CYP27B1) che codifica 25-idrossivitamina D 1-idrossilasi (1-idrossislasi), che catalizza fisiologicamente la sintesi di 1,25(OH)₂D. L’altro gene è l’aldeide dehydrogenasi 1 membro della famiglia A2 (ALDH1a2) che codifica retinaldeide dehydrogenasi 2 (RALDH2), che catalizza fisiologicamente la sintesi di RA⁶.

Poiché l’aumento in vivo dell’induzione delle cellule Treg gut-homing è potenzialmente importante nel trattamento dell’IBD, nel seguente protocollo ildettagliamo le procedure per la generazione dei DC inesprimibili 1-idrossilasi-RALDH2 (cellule DC-CYP-ALDH) che può essere utilizzato per la futura indagine sulle cellule Treg gut-homing in vivo.