In vivo augmentatie van gut-homing regulatoire T Cell inductie
Summary
Hier presenteren we een protocol voor in vivo vergroting van gut-homing regulatoire T Cell inductie. In dit protocol zijn dendritische cellen ontworpen om lokaal hoge concentraties van de actieve vitamine D (1,25-dihydroxyvitamin D of 1,25 [OH]2d) en de actieve vitamine A (retinoïnezuur of RA) de Novo te produceren.
Abstract
Inflammatoire darmziekte (IBD) is een inflammatoire chronische ziekte in het maagdarmkanaal (DARM). In de Verenigde Staten zijn er ongeveer 1.400.000 IBD patiënten. Het is algemeen aanvaard dat een disgereguleerde immuunrespons op darmbacteriën de ziekte initieert en de mucosale epitheliale barrière verstoort. We hebben onlangs laten zien dat gut-homing Regulatory T (Treg) cellen een veelbelovende therapie voor IBD zijn. Dienovereenkomstig, dit artikel presenteert een protocol voor in vivo augmentatie van gut-homing Treg Cell inductie. In dit protocol zijn dendritische cellen ontworpen voor de productie van lokaal hoge concentraties van twee moleculen de Novo, actieve vitamine D (1,25-dihydroxyvitamin D of 1,25 [OH]2D) en actieve vitamine A (retinoïnezuur of RA). We kozen voor 1,25 (OH)2d en RA op basis van eerdere bevindingen waaruit blijkt dat 1,25 (Oh)2D de expressie van regelgevende moleculen kan induceren (bijv. Forkhead Box P3 en interleukine-10) en dat Ra de expressie van gut-homing-receptoren in T-cellen kan stimuleren. Om dergelijke engineered dendritische cellen te genereren, gebruiken we een lentivirale vector om dendritische cellen te doorgeven om twee genen te overdrukken. Een gen is de cytochroom P450 familie 27 subfamilie B lid 1 die codeert 25-hydroxyvitamin D 1α-hydroxylase, die fysiologisch katalyseert de synthese van 1,25 (OH)2D. Het andere gen is de aldehyde dehydrogenase 1 familie lid a2 die codeert voor retinaldehyde dehydrogenase 2, die fysiologisch de synthese van RA katalyseert. Dit protocol kan worden gebruikt voor toekomstig onderzoek naar gut-homing Treg cellen in vivo.
Introduction
Inflammatoire darmziekte (IBD) is een inflammatoire chronische ziekte in het maagdarmkanaal (DARM). In de Verenigde Staten zijn er ongeveer 1.400.000 IBD patiënten. Het is algemeen aanvaard dat een disgereguleerde immuunrespons op darmbacteriën de ziekte initieert en de mucosale epitheliale barrière1,2verstoort. Om deze reden, momenteel beschikbare U.S. Food and Drug Administration (FDA)-goedgekeurde drugs remmen de functies van inflammatoire mediatoren of blokkeren het homing van immune cellen in de darm. Echter, de ontstekingsmediatoren en immuuncellen die gericht zijn zijn ook nodig voor immuun afweer. Dientengevolge, de inflammatoire mediator remmers compromitteren systemische immuun verdediging en de immuuncel homing blokkers verzwakken gut immuun verdediging, die beide kunnen leiden tot ernstige gevolgen3,4. Bovendien, de immuuncel homing blokkers kunnen ook blokkeren het homing van regelgevende T (Treg) cellen in de darm en dus kan verergeren de reeds gecompromitteerde gut immuun tolerantie bij IBD patiënten. Bovendien, blokkeren van Treg cel homing in de darm kan ook leiden tot systemische immuunsuppressie als gevolg van de accumulatie van Treg cellen in het bloed5. Tot slot, remmers en blokkers functioneren tijdelijk en, daardoor, vereisen frequente toedieningen. Frequente toediening van deze remmers en blokkers kan verder verergeren de ongewenste neveneffecten.
Onlangs, we hebben voorgesteld een nieuwe strategie die potentieel kan verzachten of zelfs elimineren van de bijwerkingen geassocieerd met de huidige drugs voor IBD behandeling6. Deze strategie vergroot de inductie van gut-homing Treg cellen in perifere lymfoïde weefsels6. De logica van deze strategie is dat gut-homing Treg cellen specifiek de thuisbasis van de darm en dus zal niet in gevaar brengen systemische immuun afweer. Bovendien, aangezien Treg cellen potentieel geheugen kunnen vormen7,8, gut-homing Treg cellen kunnen mogelijk zorgen voor een stabiele controle van de chronische darmontsteking bij IBD patiënten en, daardoor, de behandeling moet niet zo frequent worden toegediend. Bovendien, aangezien deze strategie de inductie van gut-homing Treg cellen in vivo vergroot, heeft het niet de zorg van in vivo instabiliteit in een zeer proinflammatoire omgeving die gepaard gaat met adoptie overdracht van in vitro gegenereerde Treg cellen9,10. In dit verband, in vitro gegenereerde Treg cellen zijn een van de voorgestelde strategieën voor de behandeling van auto-immuunziekten11,12,13 en transplantatie afstoting14,15. Tot slot, in deze strategie, dendritische cellen (DCs) zijn ontworpen om lokaal hoge concentraties van twee moleculen de Novo te produceren: actieve vitamine D (1,25-dihydroxyvitamin D of 1,25 [OH]2D) en actieve vitamine A (retinoïnezuur of RA). We kozen voor 1,25 (Oh)2d en RA omdat 1,25 (Oh)2d de expressie van regelgevende moleculen kan induceren (bijv. Forkhead Box P3 [foxp3] en interleukine-10 [Il-10])16,17 en dat Ra de expressie van gut-homing-receptoren in T-cellen kan stimuleren18. Omdat zowel 1,25 (Oh)2D en RA ook de DCS28,29kunnen vertolderen, reden we dat de engineered DCS in vivo in een tolerogene toestand zal worden gehandhaafd en daarmee de in vivo instabiliteit problemen die geassocieerd zijn met in vitro gegenereerde tolerogene dc’s (toldc’s)19,20,21te omzeilen. In dit opzicht zijn toldc’s ook een van de voorgestelde strategieën voor in vivo vergroting van de Treg-celfuncties19,20,21. Ter ondersteuning van onze redenering, hebben we aangetoond dat de engineered DCs, bij in vivo levering, kan de inductie van gut-homing Treg cellen in perifere lymfoïde weefsels te vergroten6.
Een bijkomend voordeel van onze voorgestelde strategie is dat 1,25 (OH)2D ook andere functies heeft die mogelijk ten goede komen aan IBD-patiënten. Deze andere functies omvatten het vermogen van 1,25 (OH)2D om de secretie van antimicrobiële geneesmiddelen22 te stimuleren en carcinogenese23te onderdrukken. Infecties en kankers worden vaak geassocieerd met IBD24,25.
Om de DCs te genereren die lokaal hoge concentraties van zowel 1,25 (OH)2D en Ra de Novo kan produceren, gebruiken we een lentivirale vector om DCS te overdrukken om twee genen over te brengen. Een gen is de cytochroom P450 familie 27 subfamilie B lid 1 (CYP27B1) die codeert 25-hydroxyvitamin D 1α-hydroxylase (1α-hydroxylase), die fysiologisch katalyseert de synthese van 1,25 (OH)2D. Het andere gen is de aldehyde-dehydrogenase 1-familielid a2 (ALDH1a2) die de retinaldehyde dehydrogenase 2 (RALDH2) codeert, wat de synthese van RA6fysiologisch katalyseert.
Omdat in vivo augmentatie van gut-homing Treg Cell inductie is mogelijk belangrijk bij de behandeling van IBD, in het volgende protocol zullen we de procedures voor het genereren van de 1α-hydroxylase-RALDH2-overuitdrukken DCs (DC-CYP-ALDH cellen) die kan gebruikt worden voor het toekomstig onderzoek van de Treg cellen in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel beschrijven we het gebruik van DC-CYP-ALDH cellen, voor het verhogen van de inductie van gut-homing Treg cellen in perifere lymfoïde weefsels. Onze gegevens hebben aangetoond dat de DC-CYP-ALDH-cellen lokaal hoge concentraties de Novo van zowel 1,25 (OH)2D en RA in vitro kunnen synthetiseren in de aanwezigheid van overeenkomstige substraten (d.w.z. 25 [Oh] D en retinol, respectievelijk). Omdat voldoende bloed concentraties van 25 (Oh) D en retinol gemakkelijk kunnen worden bereikt door middel v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door het Bureau van de adjunct-secretaris van defensie voor gezondheidszaken via het peer reviewed medisch onderzoeksprogramma onder Awardnr. W81XWH-15-1-0240 (XT). Meningen, interpretaties, conclusies en aanbevelingen zijn die van de auteur en worden niet noodzakelijkerwijs onderschreven door het ministerie van defensie. Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door onderzoeks-innovatie subsidies van het departement geneeskunde aan de Loma Linda University (681207-2967 [XT en GG], 681205-2967 [XT] en 325491 [DJB]).
Materials
| 10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
| 100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
| 12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
| 150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
| 25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| 6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
| ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
| Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
| CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
| Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
| DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
| Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
| Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
| HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
| Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
| Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
| Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
| Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
| Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
| Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
| Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
| Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
| RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
| Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
| Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
| Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |
References
- Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. New England Journal of Medicine. 361 (21), 2066-2078 (2009).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual Reviews in Immunology. 28, 573-621 (2010).
- Clifford, D. B., et al. Natalizumab-associated progressive multifocal leukoencephalopathy in patients with multiple sclerosis: lessons from 28 cases. Lancet Neurology. 9 (4), 438-446 (2010).
- Linda, H., et al. Progressive multifocal leukoencephalopathy after natalizumab monotherapy. New England Journal of Medicine. 361 (11), 1081-1087 (2009).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Xu, Y., et al. In Vivo Generation of Gut-Homing Regulatory T Cells for the Suppression of Colitis. Journal of Immunology. 202 (12), 3447-3457 (2019).
- Rosenblum, M. D., Way, S. S., Abbas, A. K. Regulatory T cell memory. Nature Reviews Immunology. 16 (2), 90-101 (2016).
- Grimm, A. J., Kontos, S., Diaceri, G., Quaglia-Thermes, X., Hubbell, J. A. Memory of tolerance and induction of regulatory T cells by erythrocyte-targeted antigens. Science Report. 5, 15907 (2015).
- Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350 (6258), 334-339 (2015).
- Bhela, S., et al. The Plasticity and Stability of Regulatory T Cells during Viral-Induced Inflammatory Lesions. Journal of Immunology. 199 (4), 1342-1352 (2017).
- Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Translational Medicine. 7 (315), (2015).
- Marek-Trzonkowska, N., et al. Therapy of type 1 diabetes with CD4(+)CD25(high)CD127-regulatory T cells prolongs survival of pancreatic islets – results of one year follow-up. Clinical Immunology. 153 (1), 23-30 (2014).
- Desreumaux, P., et al. Safety and efficacy of antigen-specific regulatory T-cell therapy for patients with refractory Crohn’s disease. Gastroenterology. 143 (5), 1201-1202 (2012).
- Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117 (14), 3921-3928 (2011).
- Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117 (3), 1061-1070 (2011).
- Kang, S. W., et al. 1,25-Dihyroxyvitamin D3 promotes FOXP3 expression via binding to vitamin D response elements in its conserved noncoding sequence region. Journal of Immunology. 188 (11), 5276-5282 (2012).
- Correale, J., Ysrraelit, M. C., Gaitan, M. I. Immunomodulatory effects of Vitamin D in multiple sclerosis. Brain. 132, 1146-1160 (2009).
- Iwata, M., et al. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Vicente-Suarez, I., Brayer, J., Villagra, A., Cheng, F., Sotomayor, E. M. TLR5 ligation by flagellin converts tolerogenic dendritic cells into activating antigen-presenting cells that preferentially induce T-helper 1 responses. Immunology Letters. 125 (2), 114-118 (2009).
- Danova, K., et al. NF-kappaB, p38 MAPK, ERK1/2, mTOR, STAT3 and increased glycolysis regulate stability of paricalcitol/dexamethasone-generated tolerogenic dendritic cells in the inflammatory environment. Oncotarget. 6 (16), 14123-14138 (2015).
- Liu, P. T., et al. Toll-like receptor triggering of a vitamin D-mediated human antimicrobial response. Science. 311 (5768), 1770-1773 (2006).
- Cao, H., et al. Application of vitamin D and vitamin D analogs in acute myelogenous leukemia. Experimental Hematology. 50, 1-12 (2017).
- Anderson, A., et al. Lasting Impact of Clostridium difficile Infection in Inflammatory Bowel Disease: A Propensity Score Matched Analysis. Inflammatory Bowel Disease. 23 (12), 2180-2188 (2017).
- Tsai, J. H., et al. Association of Aneuploidy and Flat Dysplasia With Development of High-Grade Dysplasia or Colorectal Cancer in Patients With Inflammatory Bowel Disease. Gastroenterology. 153 (6), 1492-1495 (2017).
- Lee, H. W., et al. Tracking of dendritic cell migration into lymph nodes using molecular imaging with sodium iodide symporter and enhanced firefly luciferase genes. Science Reports. 5, 9865 (2015).
- Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. Journal of Immunology. 158 (6), 2723-2730 (1997).
- Okada, N., et al. Administration route-dependent vaccine efficiency of murine dendritic cells pulsed with antigens. British Journal of Cancer. 84 (11), 1564-1570 (2001).
- Li, C. H., et al. Dendritic cells, engineered to overexpress 25-hydroxyvitamin D 1alpha-hydroxylase and pulsed with a myelin antigen, provide myelin-specific suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis. FASEB J. , (2017).
- Narula, N., et al. Impact of High-Dose Vitamin D3 Supplementation in Patients with Crohn’s Disease in Remission: A Pilot Randomized Double-Blind Controlled Study. Digestive Disease Science. 62 (2), 448-455 (2017).
- Ahmad, S. M., et al. Vitamin A Supplementation during Pregnancy Enhances Pandemic H1N1 Vaccine Response in Mothers, but Enhancement of Transplacental Antibody Transfer May Depend on When Mothers Are Vaccinated during Pregnancy. Journal of Nutrition. 148 (12), 1968-1975 (2018).
- Noronha, S. M. R., et al. Aldefluor protocol to sort keratinocytes stem cells from skin. Acta Cirurgica Brasileira. 32 (11), 984-994 (2017).
- Ferreira, G. B., et al. Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways. Cell Reports. 10 (5), 711-725 (2015).
- Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells. Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).
