腸内調節制御T細胞誘導の生体内増強
Summary
ここでは、腸内ホーミング調節T細胞誘導の生体内増強のためのプロトコルを提示する。このプロトコルでは、樹状細胞は、活性ビタミンD(1,25−ジヒドロキシビタミンDまたは1,25[OH]2D)および活性ビタミンA(レチノイン酸またはRA)de novoの高濃度を局所的に産生するように設計される。
Abstract
炎症性腸疾患(IBD)は、消化管(GUT)における炎症性慢性疾患である。米国では、約140万人のIBD患者がいます。腸内細菌に対する調節不全の免疫応答が疾患を開始し、粘膜上皮障壁を破壊することは一般に受け入れられている。我々は最近、腸内調節T(Treg)細胞がIBDに対する有望な治療法であることを示した。したがって、この記事では、腸内ホーミングTreg細胞誘導の生体内増強のためのプロトコルを提示する。このプロトコルでは、樹状細胞は、2つの分子deノボ、活性ビタミンD(1,25−ジヒドロキシビタミンDまたは1,25[OH]2D)および活性ビタミンA(レチノイン酸またはRA)の局所的に高濃度を産生するように設計される。我々は、1,25(OH)2Dが調節分子(例えば、フォークヘッドボックスP3およびインターロイキン-10)の発現を誘導し、RAがT細胞における腸内受容体の発現を刺激できることを示す以前の知見に基づいて1,25(OH)2DおよびRAを選択した。このような工学的樹状細胞を生成するために、レンチウイルスベクターを使用して樹状細胞を伝調し、2つの遺伝子を過剰発現させます。1つの遺伝子は、25−ヒドロキシビタミンD1α−ヒドロキシラーゼをコードするシトクロムP450ファミリー27サブファミリーBメンバー1であり、これは1,25(OH)2Dの合成を生理学的に触媒する。他の遺伝子は、レチナルアルデヒドデヒドロゲナーゼ2をコードするアルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリーメンバーA2であり、RAの合成を生理学的に触媒する。このプロトコルは、生体内の腸ホーミングTreg細胞の将来の調査に使用することができます。
Introduction
炎症性腸疾患(IBD)は、消化管(GUT)における炎症性慢性疾患である。米国では、約140万人のIBD患者がいます。腸内細菌に対する調節不全の免疫応答が疾患を開始し、粘膜上皮バリア1、2を破壊することが一般的に受け入れられている。このため、現在利用可能な米国食品医薬品局(FDA)承認薬物は、炎症メディエーターの機能を阻害するか、腸内の免疫細胞のホーミングをブロックする。しかし、標的とされる炎症性メディエーターや免疫細胞も免疫防御に必要です。その結果、炎症性メディエーター阻害剤は全身免疫防御を損ない、免疫細胞ホーミング遮断薬は腸内免疫防御を弱め、いずれも重篤な結果につながる可能性がある3、4。さらに、免疫細胞ホーミングブロッカーはまた、腸内の調節T(Treg)細胞のホーミングをブロックすることができ、したがって、IBD患者における既に侵害された腸内免疫寛容を悪化させることができる。さらに、腸内へのTreg細胞ホーミングの遮断は、血液5中のTreg細胞の蓄積による全身免疫抑制にもつながる可能性がある。最後に、阻害剤およびブロッカーは一過性に機能し、それによって頻繁な投与を必要とする。これらの阻害剤およびブロッカーの頻繁な投与は、さらに不利な副作用を悪化させる可能性があります。
最近、我々は潜在的に軽減またはIBD治療のための現在の薬物に関連する副作用を排除することができる新しい戦略を提案しました6.この戦略は、末梢リンパ組織6における腸ホーミングTreg細胞の誘導を増強する。この戦略の根拠は、腸のホーミングTreg細胞が腸に特異的に家であり、したがって、全身性免疫防御を損なわないということです.さらに、Treg細胞は記憶7、8を形成する可能性があるため、腸内ホーミングTreg細胞はIBD患者における慢性腸炎の安定した制御を提供する可能性があり、それによって、治療を頻繁に投与する必要はない。さらに、この戦略は、生体内における腸ホーミングTreg細胞の誘導を増強するので、インビトロ発生Treg細胞9、10の養子移入に関連する高炎症性環境における生体内不安定性の懸念を有しない。この点に関して、in vitro生成Treg細胞は、自己免疫疾患11、12、13および移植拒絶反応14、15の治療のための提案された戦略の1つである。最後に、この戦略では、樹状細胞(DC)は、活性ビタミンD(1,25-ジヒドロキシビタミンDまたは1,25[OH]2D)および活性ビタミンA(レチノイン酸またはRA)の2つの分子の局所的に高濃度を生成するように設計されています。1,25(OH)2DとRAを選んだのは、1,25(OH)2Dが調節分子(例えば、フォークヘッドボックスP3[foxp3]およびインターロイキン-10[IL-10])16、17、RAがT細胞18における腸ホーミング受容体の発現を刺激することができるからである。1,25(OH)2D と RA の両方が DC28,29を許容できるため、設計された DC が生体内の対レフォゲン状態で安定的に維持され、したがって、インビトロ生成トレロゲン DC (TolDCs)19,20,21に関連する生体内不安定性の懸念を回避する理由 .この点で、TolDCはまた、Treg細胞機能19、20、21の生体内増強のための提案された戦略の一つである。我々の推論を支持するために、我々は、設計されたDCが生体内送達時に、末梢リンパ組織6における腸ホーミングTreg細胞の誘導を増強できることを示した。
私たちの提案された戦略のもう一つの利点は、1,25(OH)2 Dはまた、潜在的にIBD患者に利益をもたらす可能性のある他の機能を持っているということです。これらの他の機能は、抗菌剤22の分泌を刺激し、発癌を抑制する1,25(OH)2Dの能力を含む。感染症や癌は、しばしばIBD24、25に関連付けられています。
1,25(OH)2DとRA de novoの両方の局所的に高濃度を生成できるDCを生成するために、2つの遺伝子を過剰発現するためにDCを設計するためにレンチウイルスベクターを使用しています。1つの遺伝子は、25−ヒドロキシビタミンD1α−ヒドロキシラーゼ(1α-ヒドロキシラーゼ)をコードするシトクロムP450ファミリー27サブファミリーBメンバー1(CYP27B1)であり、これは1,25(OH)2Dの合成を生理学的に触媒する。他の遺伝子は、レチンアルデヒドデヒドロゲナーゼ2(RALDH2)をコードするアルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリーメンバーA2(ALDH1a2)であり、RA6の合成を生理学的に触媒する。
生体内での腸内ホーミングTreg細胞誘導はIBDの治療において潜在的に重要であるため、以下のプロトコルでは、1α-ヒドロキシラーゼ-RALDH2-過剰発現DC(DC-CYP-ALDH細胞)の生成手順を詳述します。生体内の腸ホーミングTreg細胞の将来の調査に使用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、末梢リンパ組織における腸ホーミングTreg細胞の誘導を増強するためのDC-CYP-ALDH細胞の使用について説明する。我々のデータは、DC-CYP-ALDH細胞が対応する基質(すなわち、25[OH]Dおよびレチノール)の存在下でインビトロで1,25(OH)2DおよびRAの両方の局所的に高濃度のde novoを合成できることを示している。25(OH)Dとレチノールの十分な血中濃度は、欠乏症30、31…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、第1報のピアレビュー医学研究プログラムを通じて、国防次官補事務局の支援を受けました。W81XWH-15-1-0240 (XT)意見、解釈、結論、および勧告は著者のものであり、必ずしも国防総省によって承認されるものではありません。この研究はまた、ロマリンダ大学医学科(681207-2967[XTとGG]、681205-2967[XT]、および325491[DJB])からの研究イノベーション助成金によって部分的にサポートされました。
Materials
| 10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
| 100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
| 12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
| 150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
| 25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| 6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
| ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
| Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
| CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
| Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
| DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
| Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
| Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
| HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
| Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
| Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
| Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
| Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
| Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
| Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
| Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
| Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
| RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
| Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
| Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
| Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |
References
- Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. New England Journal of Medicine. 361 (21), 2066-2078 (2009).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual Reviews in Immunology. 28, 573-621 (2010).
- Clifford, D. B., et al. Natalizumab-associated progressive multifocal leukoencephalopathy in patients with multiple sclerosis: lessons from 28 cases. Lancet Neurology. 9 (4), 438-446 (2010).
- Linda, H., et al. Progressive multifocal leukoencephalopathy after natalizumab monotherapy. New England Journal of Medicine. 361 (11), 1081-1087 (2009).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Xu, Y., et al. In Vivo Generation of Gut-Homing Regulatory T Cells for the Suppression of Colitis. Journal of Immunology. 202 (12), 3447-3457 (2019).
- Rosenblum, M. D., Way, S. S., Abbas, A. K. Regulatory T cell memory. Nature Reviews Immunology. 16 (2), 90-101 (2016).
- Grimm, A. J., Kontos, S., Diaceri, G., Quaglia-Thermes, X., Hubbell, J. A. Memory of tolerance and induction of regulatory T cells by erythrocyte-targeted antigens. Science Report. 5, 15907 (2015).
- Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350 (6258), 334-339 (2015).
- Bhela, S., et al. The Plasticity and Stability of Regulatory T Cells during Viral-Induced Inflammatory Lesions. Journal of Immunology. 199 (4), 1342-1352 (2017).
- Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Translational Medicine. 7 (315), (2015).
- Marek-Trzonkowska, N., et al. Therapy of type 1 diabetes with CD4(+)CD25(high)CD127-regulatory T cells prolongs survival of pancreatic islets – results of one year follow-up. Clinical Immunology. 153 (1), 23-30 (2014).
- Desreumaux, P., et al. Safety and efficacy of antigen-specific regulatory T-cell therapy for patients with refractory Crohn’s disease. Gastroenterology. 143 (5), 1201-1202 (2012).
- Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117 (14), 3921-3928 (2011).
- Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117 (3), 1061-1070 (2011).
- Kang, S. W., et al. 1,25-Dihyroxyvitamin D3 promotes FOXP3 expression via binding to vitamin D response elements in its conserved noncoding sequence region. Journal of Immunology. 188 (11), 5276-5282 (2012).
- Correale, J., Ysrraelit, M. C., Gaitan, M. I. Immunomodulatory effects of Vitamin D in multiple sclerosis. Brain. 132, 1146-1160 (2009).
- Iwata, M., et al. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Vicente-Suarez, I., Brayer, J., Villagra, A., Cheng, F., Sotomayor, E. M. TLR5 ligation by flagellin converts tolerogenic dendritic cells into activating antigen-presenting cells that preferentially induce T-helper 1 responses. Immunology Letters. 125 (2), 114-118 (2009).
- Danova, K., et al. NF-kappaB, p38 MAPK, ERK1/2, mTOR, STAT3 and increased glycolysis regulate stability of paricalcitol/dexamethasone-generated tolerogenic dendritic cells in the inflammatory environment. Oncotarget. 6 (16), 14123-14138 (2015).
- Liu, P. T., et al. Toll-like receptor triggering of a vitamin D-mediated human antimicrobial response. Science. 311 (5768), 1770-1773 (2006).
- Cao, H., et al. Application of vitamin D and vitamin D analogs in acute myelogenous leukemia. Experimental Hematology. 50, 1-12 (2017).
- Anderson, A., et al. Lasting Impact of Clostridium difficile Infection in Inflammatory Bowel Disease: A Propensity Score Matched Analysis. Inflammatory Bowel Disease. 23 (12), 2180-2188 (2017).
- Tsai, J. H., et al. Association of Aneuploidy and Flat Dysplasia With Development of High-Grade Dysplasia or Colorectal Cancer in Patients With Inflammatory Bowel Disease. Gastroenterology. 153 (6), 1492-1495 (2017).
- Lee, H. W., et al. Tracking of dendritic cell migration into lymph nodes using molecular imaging with sodium iodide symporter and enhanced firefly luciferase genes. Science Reports. 5, 9865 (2015).
- Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. Journal of Immunology. 158 (6), 2723-2730 (1997).
- Okada, N., et al. Administration route-dependent vaccine efficiency of murine dendritic cells pulsed with antigens. British Journal of Cancer. 84 (11), 1564-1570 (2001).
- Li, C. H., et al. Dendritic cells, engineered to overexpress 25-hydroxyvitamin D 1alpha-hydroxylase and pulsed with a myelin antigen, provide myelin-specific suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis. FASEB J. , (2017).
- Narula, N., et al. Impact of High-Dose Vitamin D3 Supplementation in Patients with Crohn’s Disease in Remission: A Pilot Randomized Double-Blind Controlled Study. Digestive Disease Science. 62 (2), 448-455 (2017).
- Ahmad, S. M., et al. Vitamin A Supplementation during Pregnancy Enhances Pandemic H1N1 Vaccine Response in Mothers, but Enhancement of Transplacental Antibody Transfer May Depend on When Mothers Are Vaccinated during Pregnancy. Journal of Nutrition. 148 (12), 1968-1975 (2018).
- Noronha, S. M. R., et al. Aldefluor protocol to sort keratinocytes stem cells from skin. Acta Cirurgica Brasileira. 32 (11), 984-994 (2017).
- Ferreira, G. B., et al. Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways. Cell Reports. 10 (5), 711-725 (2015).
- Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells. Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).
