Summary

Cultivo In Vitro de Células Epiteliales de Diferentes Regiones Anatómicas de la Membrana Amniótica Humana

Published: November 28, 2019
doi:

Summary

Este protocolo describe el aislamiento de células epiteliales de diferentes regiones anatómicas de la membrana amniótica humana para determinar su heterogeneidad y propiedades funcionales para su posible aplicación en modelos clínicos y fisiopatológicos.

Abstract

Se han reportado varios protocolos en la literatura para el aislamiento y el cultivo de células epiteliales amnióticas humanas (HAEC). Sin embargo, estos suponen que el epitelio amniótico es una capa homogénea. El amnion humano se puede dividir en tres regiones anatómicas: reflejada, placentaria y umbilical. Cada región tiene diferentes funciones fisiológicas, como en condiciones patológicas. Aquí, describimos un protocolo para diseccionar el tejido amnión humano en tres secciones y mantenerlo in vitro. En el cultivo, las células derivadas del amnion reflejado mostraron una morfología cuboidal, mientras que las células de las regiones placentaria y umbilical eran escamosas. No obstante, todas las células obtenidas tienen un fenotipo epitelial, demostrado por la inmunodetección de la E-cadherina. Por lo tanto, debido a que las regiones placentarias y reflejadas in situ difieren en los componentes celulares y las funciones moleculares, puede ser necesario que los estudios in vitro consideren estas diferencias, ya que podrían tener implicaciones fisiológicas para el uso de HAEC en investigación biomédica y la aplicación prometedora de estas células en la medicina regenerativa.

Introduction

Las células del epitelio amniótico humano (HAEC) se originan durante las primeras etapas del desarrollo embrionario, alrededor de ocho días después de la fertilización. Surgen de una población de células epiteliales escamosas del epiblasto que derivan de la capa más interna de la membrana amniótica1. Por lo tanto, HAEC se consideran restos de células pluripotentes del epiblasto que tienen el potencial de diferenciarse en las tres capas germinales del embrión2. En la última década, diversos grupos de investigación han desarrollado métodos para aislar estas células de la membrana amniótica a término de gestación para caracterizar sus propiedades presuntas relacionadas con la pluripotencia en un modelo de cultivo in vitro3,4.

En consecuencia, se ha encontrado que HAEC presenta rasgos característicos de las células madre pluripotentes humanas (HPSC), como los antígenos superficiales SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; el núcleo de los factores de transcripción pluripotencia OCT4, SOX2 y NANOG; y el marcador de proliferación KI67, lo que sugiere que se autornuevan5,6,7. Además, estas células han sido desafiadas utilizando protocolos de diferenciación para obtener células positivas para marcadores específicos de linaje de las tres capas germinales (ectodermo, mesodermo y endoderm)4,5,8, así como en modelos animales de enfermedades humanas. Por último, HAEC expresa E-cadherin, que demuestran que conservan una naturaleza epitelial muy similar a la HPSC5,9.

Aparte de su origen embrionario, HAEC tiene otras propiedades intrínsecas que las hacen adecuadas para diferentes aplicaciones clínicas, como la secreción de moléculas antiinflamatorias y antibacterianas10,11, factores de crecimiento y citoquinaliberación 12,sin formación de teratomas cuando se trasplantan en ratones inmunodeficientes en contraste con HPSC2,y tolerancia inmunológica porque expresan HLA-G, lo que disminuye el riesgo de rechazo después de trasplante13.

Sin embargo, informes anteriores han supuesto que el amnion humano es una membrana homogénea, sin tener en cuenta que puede dividirse anatómica y fisiológicamente en tres regiones: placenta (el amnion que cubre la decidua basalis),umbilical (la parte que envuelve el cordón umbilical), y reflejado (el resto de la membrana no unida a la placenta)14. Se ha demostrado que las regiones placentarias y reflejadas del amnión muestran diferencias en morfología, actividad mitocondrial, detección de especies reactivas de oxígeno15,expresión de miRNA16,y activación de las vías de señalización17. Estos resultados sugieren que el amnion humano está integrado por una población heterogénea con una funcionalidad diferente que debe considerarse para estudios posteriores realizados en modelos in situ o in vitro. Mientras que otros laboratorios han diseñado protocolos para el aislamiento de HAEC de toda la membrana, nuestro laboratorio ha establecido un protocolo para aislar, cultivar y caracterizar células de diferentes regiones anatómicas.

Protocol

Este protocolo fue aprobado por el comité ético del Instituto Nacional de Perinatología en la Ciudad de México (Número de Registro 212250-21041). Todos los procedimientos realizados en estos estudios se ajustaron a las normas éticas del Instituto Nacional de Perinatología, la Declaración de Helsinki y las directrices establecidas en la Norma Oficial Mexicana del Ministerio de Salud. 1. Preparación Prepare una solución de 1x PBS con EDTA. Para ello, añada 500 ml de stock ED…

Representative Results

Los HAEC se aislaron de cada una de las tres regiones anatómicas de la membrana amniótica y se cultivaron individualmente in vitro. Después de 48 h de cultivo, las células con un fenotipo epitelial se adhirieron a la superficie de la placa, aunque el medio también contenía desechos celulares y células flotantes, que se eliminaron una vez que se cambió el medio(Figura 3). Durante el procesamiento del cultivo primario (pasaje cero, P0), podrían surgir algun…

Discussion

Implementamos un nuevo protocolo para aislar HAEC de las membranas de términos. Se diferencia de los informes anteriores en que cada membrana se dividió en sus tres regiones anatómicas antes del aislamiento para analizar las células de cada una.

Uno de los pasos más críticos en el protocolo es el lavado de la membrana para eliminar todos los coágulos sanguíneos, ya que pueden interferir con la actividad de la trippsina al separar las células epiteliales. No llevar a cabo este paso cor…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nuestra investigación fue apoyada por subvenciones del Instituto Nacional de Perinatología de México (21041 y 21081) y CONACYT (A1-S-8450 y 252756). Agradecemos a Jessica González Norris y Lidia Yuriria Paredes Vivas por el apoyo técnico.

Materials

Culture reagents
2-Mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific/Gibco 21985023 55 mM
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific/Gibco 15240062 100X
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific/Gibco 12430054 Supplemented with high glucose and HEPES
EDTA Thermo Fisher Scientific/Ambion AM9260G 0.5 M
Embryonic stem-cell FBS, qualified Thermo Fisher Scientific/Gibco 10439024
Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher Scientific/Gibco 11140050 100X
Paraformaldehyde any brand
Phosphate-Buffered Saline Thermo Fisher Scientific/Gibco 10010023 1X
Saline solution (sodium chloride 0.9%) any brand
Sodium Pyruvate Thermo Fisher Scientific/Gibco 11360070 100 mM
Trypsin/EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific/Gibco 25300054
Disposable material
100 µm Cell Strainer Corning/Falcon 352360
100 mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3526
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3516
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube any brand with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl.
Sterile cotton gauzes
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL any brand
Sterile surgical gloves any brand
Equipment
Biological safety cabinet
Centrifuge
Micropipettes
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Sterile beakers of 500 mL
Sterile plastic cutting board
Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps
Sterile stainless steel container
Sterile tray
Tube Rotator MaCSmix
Antibodies and Kits Antibody ID
Anti-E-cadherin BD Biosciences 610181 RRID:AB_3975
Anti-KI67 Santa Cruz 23900 RRID:AB_627859)
Anti-NANOG Peprotech 500-P236 RRID:AB_1268274
Anti-OCT4 Abcam ab19857 RRID:AB_44517
Anti-SOX2 Millipore AB5603 RRID:AB_2286686
Anti-SSEA-4 Cell Signaling 4755 RRID:AB_1264259
Anti-TRA-1-60 Cell Signaling 4746 RRID:AB_2119059
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11029 RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-11036 RRID:AB_10563566
Tunel Assay Kit Abcam 66110

References

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Avila-González, D., García-López, G., Díaz-Martínez, N. E., Flores-Herrera, H., Molina-Hernández, A., Portillo, W., Díaz, N. F. In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane. J. Vis. Exp. (153), e60551, doi:10.3791/60551 (2019).

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