In vitro cultuur van epitheelcellen uit verschillende anatomische gebieden van het humaan Amniotische membraan
Summary
Dit protocol beschrijft de isolatie van epitheelcellen uit verschillende anatomische gebieden van het humaan amniotische membraan om hun heterogeniteit en functionele eigenschappen te bepalen voor mogelijke toepassing in klinische en physiopathologische modellen.
Abstract
Verschillende protocollen zijn gerapporteerd in de literatuur voor de isolatie en de cultuur van menselijke amniotische epitheelcellen (HAEC). Echter, deze veronderstellen dat het amniotische epitheel is een homogene laag. De menselijke amnion kan worden onderverdeeld in drie anatomische gebieden: reflecterend, Placental en navelstreng. Elke regio heeft verschillende fysiologische rollen, zoals in pathologische omstandigheden. Hier beschrijven we een protocol om humaan amnion weefsel in drie secties te ontleden en in vitro te onderhouden. In de cultuur, cellen afgeleid van de gereflecteerde amnion weergegeven een kubus morfologie, terwijl cellen uit zowel placenta en navelstreng gebieden waren plaveiselcel. Niettemin, alle verkregen cellen hebben een epitheliale fenotype, aangetoond door de immunodetectie van E-cadherin. Omdat de placenta-en weerkaatste gebieden in situ verschillen in cellulaire componenten en moleculaire functies, kan het voor in vitro studies noodzakelijk zijn om deze verschillen te overwegen, omdat ze fysiologische implicaties kunnen hebben voor het gebruik van HAEC in biomedisch onderzoek en de veelbelovende toepassing van deze cellen in regeneratieve geneeskunde.
Introduction
Humaan amniotische epitheelcellen (HAEC) ontstaan tijdens de vroege stadia van de embryonale ontwikkeling, op ongeveer acht dagen na de bevruchting. Zij komen voort uit een populatie van plaveiselcel epitheelcellen van de epiblast die afkomstig zijn van de binnenste laag van het amniotische membraan1. Zo worden HAEC beschouwd als overblijfselen van pluripotente cellen uit de epiblast die het potentieel hebben om zich te differentiëren in de drie kiem lagen van het embryo2. In de afgelopen tien jaar hebben diverse onderzoeksgroepen methoden ontwikkeld om deze cellen te isoleren van het amniotische membraan tijdens de dracht, om hun veronderstelde pluripotentie-gerelateerde eigenschappen in een cultuur model in vitro3,4te karakteriseren.
Dienovereenkomstig is gebleken dat HAEC eigenschappen kenmerken die kenmerkend zijn voor menselijke pluripotente stamcellen (HPSC), zoals de oppervlakte antigenen SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; de kern van pluripotentie transcriptiefactoren OCT4, SOX2 en NANOG; en de proliferatie marker KI67, wat suggereert dat ze zichzelf vernieuwen5,6,7. Bovendien zijn deze cellen aangevochten met behulp van differentiatie protocollen om cellen positief te verkrijgen voor Lineage-specifieke markers van de drie kiem lagen (Ectoderm, mesoderm en endoderm)4,5,8, evenals in diermodellen van menselijke ziekten. Tot slot, Haec Express E-cadherin, die aantonen dat ze een epitheel karakter behouden, net als de hpsc5,5.
Afgezien van hun embryonale oorsprong, hebben Haec andere intrinsieke eigenschappen die ze geschikt maken voor verschillende klinische toepassingen, zoals de afscheiding van ontstekingsremmende en antibacteriële moleculen10,11, groeifactoren en cytokine release12, geen vorming van teratomen wanneer ze worden getransplanteerd in immunodeficiënte muizen in tegenstelling tot hpsc2, en immunologische tolerantie omdat ze HLA-G uitdrukken, wat het risico op afstoting na transplantatie13.
Uit eerdere rapporten is echter uitgegaan dat de humane amnion een homogeen membraan is, zonder te overwegen dat het anatomisch en fysiologisch kan worden onderverdeeld in drie regio’s: placenta (de amnion die de Europese lork basalisbedekt), navelstreng (het deel dat de navelstreng omhult), en gereflecteerd (de rest van het membraan dat niet aan de placenta is bevestigd)14. Het is aangetoond dat de placenta en gereflecteerde gebieden van de amnion vertonen verschillen in morfologie, mitochondriale activiteit, detectie van reactieve zuurstof soorten15, Mirna expressie16, en activering van signalering trajecten17. Deze resultaten suggereren dat de menselijke amnion wordt geïntegreerd door een heterogene populatie met verschillende functionaliteit die moet worden overwogen voor verdere studies die worden uitgevoerd in zowel in situ-als in vitro-modellen. Terwijl andere laboratoria protocollen hebben ontworpen voor de isolatie van HAEC uit het hele membraan, heeft ons laboratorium een protocol opgesteld om cellen uit verschillende anatomische gebieden te isoleren, te kweken en te karakteriseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
We implementeerden een nieuw protocol om HAEC te isoleren van term membranen. Het verschilt van eerdere rapporten in dat elk membraan werd verdeeld in de drie anatomische gebieden vóór isolatie om cellen te analyseren van elk.
Een van de meest kritische stappen in het protocol is het wassen van het membraan om alle bloedstolsels te verwijderen, omdat ze de activiteit van trypsine kunnen verstoren bij het scheiden van de epitheelcellen. Het niet goed uitvoeren van deze stap kan leiden tot het…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ons onderzoek werd gesteund door subsidies van het Instituto Nacional de Perinatología de México (21041 en 21081) en CONACYT (a1-S-8450 en 252756). Wij danken Jessica González Norris en Lidia Yuriria Paredes Vivas voor de technische ondersteuning.
Materials
| Culture reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | Supplemented with high glucose and HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0.5 M |
| Embryonic stem-cell FBS, qualified | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldehyde | any brand | ||
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Saline solution (sodium chloride 0.9%) | any brand | ||
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 mM |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| Disposable material | |||
| 100 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352360 | |
| 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3516 | |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | |||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Centrifuge | |||
| Micropipettes | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Sterile beakers of 500 mL | |||
| Sterile plastic cutting board | |||
| Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps | |||
| Sterile stainless steel container | |||
| Sterile tray | |||
| Tube Rotator | MaCSmix | ||
| Antibodies and Kits | Antibody ID | ||
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | Cell Signaling | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Anti-TRA-1-60 | Cell Signaling | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Tunel Assay Kit | Abcam | 66110 |
References
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Garcia-Lopez, G., et al. Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC). Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).
- Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures. Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).
- Garcia-Castro, I. L., et al. Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons. PLoS One. 10 (12), 0146082 (2015).
- Garcia-Lopez, G., et al. Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium. Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).
- Yang, P. J., et al. Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation. Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).
- Zou, G., et al. MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation. International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).
- Avila-Gonzalez, D., et al. Capturing the ephemeral human pluripotent state. Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).
- Niknejad, H., et al. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. European Cells & Materials. 15, 88-99 (2008).
- Miki, T. Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells. American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003 (2018).
- Wu, Q., et al. Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).
- Hammer, A., et al. Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G. American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).
- Benirschke, K., et al. Anatomy and Pathology of the Placental Membranes. Pathology of the Human Placenta. , 268-318 (1995).
- Banerjee, A., et al. Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane. Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).
- Kim, S. Y., et al. miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term. PLoS One. 6 (9), 24131 (2011).
- Han, Y. M., et al. Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion. Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).
- Alcaraz, A., et al. Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells. Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).
- Canciello, A., et al. Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties. Scientific Reports. 7 (1), 3761 (2017).
- Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. Amniotic Epithelial Cell Culture. Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).
- Singh, A. M., et al. Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).
- Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal. Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).
- Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies. Physiological Reports. 3 (3), 12320 (2015).
- Avila-Gonzalez, D., et al. Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos. Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).
