Summary

In Vitro Kultur von Epithelzellen aus verschiedenen anatomischen Regionen der menschlichen Amnionmembran

Published: November 28, 2019
doi:

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Epithelzellen aus verschiedenen anatomischen Regionen der menschlichen Fruchtwassermembran, um deren Heterogenität und funktionelle Eigenschaften für eine mögliche Anwendung in klinischen und physiopathologischen Modellen zu bestimmen.

Abstract

In der Literatur wurden mehrere Protokolle zur Isolierung und Kultur menschlicher Fruchtwasserepithelzellen (HAEC) berichtet. Diese gehen jedoch davon aus, dass es sich bei dem Fruchtioziumepithel um eine homogene Schicht handelt. Das menschliche Amnion kann in drei anatomische Regionen unterteilt werden: reflektiert, Plazenta und Nabel. Jede Region hat unterschiedliche physiologische Rollen, z. B. in pathologischen Bedingungen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um menschliches Amniongewebe in drei Abschnitten zu sezieren und in vitro zu pflegen. In der Kultur zeigten Zellen, die aus dem reflektierten Amnion abgeleitet wurden, eine quakodeale Morphologie, während Zellen aus Plazenta- und Nabelregionen plattenförmig waren. Nichtsdestotrotz haben alle erhaltenen Zellen einen epitheliale Phänotyp, der durch die Immundetektion von E-Cadherin nachgewiesen wird. Da sich die Plazenta- und reflektierten Regionen vor Ort in zellulären Komponenten und molekularen Funktionen unterscheiden, kann es daher für In-vitro-Studien notwendig sein, diese Unterschiede zu berücksichtigen, da sie physiologische Auswirkungen auf die Verwendung von HAEC in biomedizinische Forschung und die vielversprechende Anwendung dieser Zellen in der regenerativen Medizin.

Introduction

Menschliche Fruchtiotische Epithelzellen (HAEC) entstehen in den frühen Stadien der embryonalen Entwicklung, etwa acht Tage nach der Befruchtung. Sie entstehen aus einer Population von Plattenepithelzellen des Epiblasts, die sich aus der innersten Schicht der Fruchtwassermembran1ableiten. So gelten HAEC als Reste pluripotenter Zellen aus dem Epiblast, die das Potenzial haben, sich in die drei Keimschichten desEmbryos 2zu differenzieren. In den letzten zehn Jahren haben verschiedene Forschungsgruppen Methoden entwickelt, um diese Zellen aus der Fruchtwassermembran zum Term der Trächtigkeit zu isolieren, um ihre mutmaßlichen pluripotenzbedingten Eigenschaften in einem Kulturmodell in vitro3,4zu charakterisieren.

Dementsprechend wurde festgestellt, dass HAEC-Merkmale, die für humane pluripotente Stammzellen (HPSC) charakteristisch sind, wie die Oberflächenantigene SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; der Kern der Pluripotenz-Transkriptionsfaktoren OCT4, SOX2 und NANOG; und der Proliferationsmarker KI67, was darauf hindeutet, dass sie sich selbsterneuern5,6,7. Darüber hinaus wurden diese Zellen mit Differenzierungsprotokollen herausgefordert, um Zellen positiv für linienspezifische Marker der drei Keimschichten (Ektoderm, Mesoderm und Endoderm)4,5,8, sowie in Tiermodellen menschlicher Krankheiten zu erhalten. Schließlich, HAEC Express E-Cadherin, die zeigen, dass sie eine epitheliale Natur ähnlich wie die HPSC5,9behalten.

Abgesehen von ihrem embryonalen Ursprung haben HAEC andere intrinsische Eigenschaften, die sie für verschiedene klinische Anwendungen geeignet machen, wie die Sekretion von entzündungshemmenden und antibakteriellen Molekülen10,11, Wachstumsfaktoren und Zytokinfreisetzung12, keine Bildung von Teratomen, wenn sie in immundefizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizide Mäuse im Gegensatz zu HPSC2transplantiert werden, und immunologische Toleranz, weil sie HLA-G ausdrücken, was das Risiko der Abstoßung nach Transplantation13.

Frühere Berichte gingen jedoch davon aus, dass das menschliche Amnion eine homogene Membran ist, ohne zu berücksichtigen, dass es anatomisch und physiologisch in drei Regionen unterteilt werden kann: Plazenta (das Amnion, das die Decidua basalisbedeckt), Nabel (der Teil, der die Nabelschnur umschließt) und reflektiert (der Rest der Membran nicht an der Plazenta befestigt)14. Es wurde gezeigt, dass die Plazenta- und reflektierten Regionen des Amnion Unterschiede in der Morphologie, mitochondrialen Aktivität, Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies15, miRNA-Expression16und Aktivierung von Signalwegen17zeigen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das menschliche Amnion von einer heterogenen Population mit unterschiedlicher Funktionalität integriert wird, die für weitere Studien in In-situ- oder In-vitro-Modellen in Betracht gezogen werden sollte. Während andere Laboratorien Protokolle für die Isolierung von HAEC von der gesamten Membran entwickelt haben, hat unser Labor ein Protokoll zur Isolierung, Kultur und Charakterisierung von Zellen aus verschiedenen anatomischen Regionen erstellt.

Protocol

Dieses Protokoll wurde von der Ethikkommission des Instituto Nacional de Perinatologa in Mexiko-Stadt (Registernummer 212250-21041) gebilligt. Alle in diesen Studien durchgeführten Verfahren entsprachen den ethischen Standards des Instituto Nacional de Perinatologa, der Erklärung von Helsinki und den Leitlinien des offiziellen mexikanischen Standards des Gesundheitsministeriums. 1. Vorbereitung Bereiten Sie eine Lösung von 1x PBS mit EDTA vor. Fügen Sie dazu 500 l 0,5 M EDTA-Best…

Representative Results

HAEC wurden aus jedem der drei anatomischen Regionen der Fruchtwassermembran isoliert und in vitro einzeln kultiviert. Nach 48 h Kultur hafteten Zellen mit einem epithelialen Phänotyp an der Oberfläche der Platte, obwohl die Medien auch Zellablagerungen und schwimmende Zellen enthielten, die nach der Änderung des Mediums entfernt wurden(Abbildung 3). Während der Verarbeitung der Primärkultur (Durchgang Null, P0) können einige Komplikationen auftreten, die di…

Discussion

Wir haben ein neues Protokoll implementiert, um HAEC von Termmembranen zu isolieren. Es unterscheidet sich von früheren Berichten dadurch, dass jede Membran vor der Isolierung in ihre drei anatomischen Bereiche unterteilt wurde, um Zellen von jedem zu analysieren.

Einer der kritischsten Schritte im Protokoll ist das Waschen der Membran, um alle Blutgerinnsel zu entfernen, da sie die Aktivität von Trypsin bei der Trennung der Epithelzellen stören können. Wenn dieser Schritt nicht ordnungsge…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Unsere Forschung wurde durch Stipendien des Instituto Nacional de Perinatologa de México (21041 und 21081) und CONACYT (A1-S-8450 und 252756) unterstützt. Wir danken Jessica Gonzalez Norris und Lidia Yuriria Paredes Vivas für die technische Unterstützung.

Materials

Culture reagents
2-Mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific/Gibco 21985023 55 mM
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific/Gibco 15240062 100X
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific/Gibco 12430054 Supplemented with high glucose and HEPES
EDTA Thermo Fisher Scientific/Ambion AM9260G 0.5 M
Embryonic stem-cell FBS, qualified Thermo Fisher Scientific/Gibco 10439024
Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher Scientific/Gibco 11140050 100X
Paraformaldehyde any brand
Phosphate-Buffered Saline Thermo Fisher Scientific/Gibco 10010023 1X
Saline solution (sodium chloride 0.9%) any brand
Sodium Pyruvate Thermo Fisher Scientific/Gibco 11360070 100 mM
Trypsin/EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific/Gibco 25300054
Disposable material
100 µm Cell Strainer Corning/Falcon 352360
100 mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3526
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3516
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube any brand with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl.
Sterile cotton gauzes
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL any brand
Sterile surgical gloves any brand
Equipment
Biological safety cabinet
Centrifuge
Micropipettes
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Sterile beakers of 500 mL
Sterile plastic cutting board
Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps
Sterile stainless steel container
Sterile tray
Tube Rotator MaCSmix
Antibodies and Kits Antibody ID
Anti-E-cadherin BD Biosciences 610181 RRID:AB_3975
Anti-KI67 Santa Cruz 23900 RRID:AB_627859)
Anti-NANOG Peprotech 500-P236 RRID:AB_1268274
Anti-OCT4 Abcam ab19857 RRID:AB_44517
Anti-SOX2 Millipore AB5603 RRID:AB_2286686
Anti-SSEA-4 Cell Signaling 4755 RRID:AB_1264259
Anti-TRA-1-60 Cell Signaling 4746 RRID:AB_2119059
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11029 RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-11036 RRID:AB_10563566
Tunel Assay Kit Abcam 66110

References

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Avila-González, D., García-López, G., Díaz-Martínez, N. E., Flores-Herrera, H., Molina-Hernández, A., Portillo, W., Díaz, N. F. In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane. J. Vis. Exp. (153), e60551, doi:10.3791/60551 (2019).

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