In Vitro Cultura das Células Epitelias de diferentes regiões anatômicas da membrana amniótica humana
Summary
Este protocolo descreve o isolamento de células epiteliais de diferentes regiões anatômicas da membrana amniótica humana para determinar sua heterogeneidade e propriedades funcionais para possível aplicação em modelos clínicos e fisiopatológicos.
Abstract
Vários protocolos foram relatados na literatura para o isolamento e a cultura das células epiteliais amnióticas humanas (HAEC). No entanto, estes assumem que o epitélio amniótico é uma camada homogênea. O amnion humano pode ser dividido em três regiões anatômicas: refletida, placentária e umbilical. Cada região tem diferentes papéis fisiológicos, como em condições patológicas. Aqui, descrevemos um protocolo para dissecar o tecido amnion humano em três seções e mantê-lo in vitro. Na cultura, as pilhas derivadas do amnion refletido indicaram uma morfologia cuboidal, quando as pilhas das regiões placental e umbilicais eram escamosas. No entanto, todas as células obtidas têm um fenótipo epiteliais, demonstrado pela imunodetecção de E-cadherin. Assim, como as regiões placentárias e refletidas in situ diferem em componentes celulares e funções moleculares, pode ser necessário que estudos in vitro considerem essas diferenças, pois podem ter implicações fisiológicas para o uso de HAEC em pesquisa biomédica e a aplicação promissora dessas células na medicina regenerativa.
Introduction
As células amnióticas do epitélio (HAEC) têm origem nos estágios iniciais do desenvolvimento embrionário, por volta de oito dias após a fertilização. Eles surgem de uma população de células epiteliais escamosas do epiblasto que derivam da camada mais interna da membrana amniótica1. Assim, haec são considerados remanescentes de células pluripotentes do epiblasto que têm o potencial de diferenciar as três camadas germinas do embrião2. Na última década, diversos grupos de pesquisa desenvolveram métodos para isolar essas células da membrana amniótica no termo da gestação para caracterizar suas propriedades presuntivas relacionadas à pluripotência em um modelo de cultura in vitro3,4.
Assim, verificou-se que haec características características características de células-tronco pluripotentes humanas (HPSC), tais como os antígenos de superfície SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; o núcleo dos fatores de transcrição da pluripotência OCT4, SOX2 e NANOG; e o marcador de proliferação KI67, sugerindo que eles são auto-renovação5,6,7. Além disso, essas células têm sido desafiadas usando protocolos de diferenciação para obter células positivas para marcadores específicos de linhagem das três camadas germinativas (ectoderme, mesoderme e endoderm)4,5,8,bem como em modelos animais de doenças humanas. Finalmente, HAEC expressar E-cadherin, que demonstram que eles mantêm uma natureza epitelial muito parecido com o HPSC5,9.
Além de sua origem embrionária, haec têm outras propriedades intrínsecas que os tornam adequados para diferentes aplicações clínicas, tais como a secreção de moléculas anti-inflamatórias e antibacterianas10,11, fatores de crescimento e citocina liberação12, nenhuma formação de teratomas quando eles são transplantados em ratos imunodeficientes em contraste com HPSC2, e tolerância imunológica, porque eles expressam HLA-G, que diminui o risco de rejeição após a rejeição transplante13.
No entanto, relatos anteriores assumiram que o amniônio humano é uma membrana homogênea, sem considerar que pode ser anatomicamente e fisiologicamente dividida em três regiões: placental (a amniônia que cobre a decidua basalis), umbilical (a parte que envolve o cordão umbilical) e refletida (o resto da membrana não ligada à placenta)14. Tem sido demonstrado que as regiões placentárias e refletidas da amniônia apresentam diferenças na morfologia, atividade mitocondrial, detecção de espécies reativas de oxigênio15,expressão miRNA16,e ativação das vias de sinalização17. Estes resultados sugerem que o amnion humano está integrado por uma população heterogênea com funcionalidade diferente que deve ser considerada para estudos mais adicionais realizados em modelos in situ ou in vitro. Enquanto outros laboratórios projetaram protocolos para o isolamento da HAEC de toda a membrana, nosso laboratório estabeleceu um protocolo para isolar, cultura e caracterizar células de diferentes regiões anatômicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Implementamos um novo protocolo para isolar a HAEC das membranas a termo. Difere dos relatórios precedentes que cada membrana estêve dividida em suas três regiões anatômicas antes da isolação para analisar pilhas de cada um.
Uma das etapas mais críticas no protocolo é a lavagem da membrana para remover todos os coágulos sanguíneos, porque eles podem interferir com a atividade da tripseao separar as células epiteliais. A falha realizar corretamente esta etapa pode conduzir a obter u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nossa pesquisa contou com o apoio de doações do Instituto Nacional de Perinatología de México (21041 e 21081) e CONACYT (A1-S-8450 e 252756). Agradecemos a Jessica González Norris e Lidia Yuriria Paredes Vivas pelo apoio técnico.
Materials
| Culture reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | Supplemented with high glucose and HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0.5 M |
| Embryonic stem-cell FBS, qualified | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldehyde | any brand | ||
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Saline solution (sodium chloride 0.9%) | any brand | ||
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 mM |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| Disposable material | |||
| 100 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352360 | |
| 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3516 | |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | |||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Centrifuge | |||
| Micropipettes | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Sterile beakers of 500 mL | |||
| Sterile plastic cutting board | |||
| Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps | |||
| Sterile stainless steel container | |||
| Sterile tray | |||
| Tube Rotator | MaCSmix | ||
| Antibodies and Kits | Antibody ID | ||
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | Cell Signaling | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Anti-TRA-1-60 | Cell Signaling | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Tunel Assay Kit | Abcam | 66110 |
References
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Garcia-Lopez, G., et al. Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC). Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).
- Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures. Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).
- Garcia-Castro, I. L., et al. Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons. PLoS One. 10 (12), 0146082 (2015).
- Garcia-Lopez, G., et al. Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium. Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).
- Yang, P. J., et al. Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation. Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).
- Zou, G., et al. MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation. International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).
- Avila-Gonzalez, D., et al. Capturing the ephemeral human pluripotent state. Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).
- Niknejad, H., et al. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. European Cells & Materials. 15, 88-99 (2008).
- Miki, T. Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells. American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003 (2018).
- Wu, Q., et al. Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).
- Hammer, A., et al. Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G. American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).
- Benirschke, K., et al. Anatomy and Pathology of the Placental Membranes. Pathology of the Human Placenta. , 268-318 (1995).
- Banerjee, A., et al. Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane. Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).
- Kim, S. Y., et al. miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term. PLoS One. 6 (9), 24131 (2011).
- Han, Y. M., et al. Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion. Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).
- Alcaraz, A., et al. Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells. Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).
- Canciello, A., et al. Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties. Scientific Reports. 7 (1), 3761 (2017).
- Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. Amniotic Epithelial Cell Culture. Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).
- Singh, A. M., et al. Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).
- Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal. Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).
- Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies. Physiological Reports. 3 (3), 12320 (2015).
- Avila-Gonzalez, D., et al. Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos. Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).
