Grabación electrofisiológica inalámbrica de las neuronas por tetrodes móviles en la natación libre de peces

Los peces son el grupo más grande y diverso de vertebrados, y al igual que otros vertebrados exhiben habilidades cognitivas complejas como navegar, socializar, dormir, cazar, etc. Sin embargo, los mecanismos neuronales que rigen el comportamiento de los peces permanecen en su mayor parte desconocidos.

En las últimas décadas, las grabaciones extracelulares de peces inmovilizados se han implementado principalmente para investigar diferentes aspectos de la base neuronal del comportamiento^1,2. Aunque esta técnica es apropiada para algunos sistemas sensoriales, la investigación de todo el espectro de la base neuronal del comportamiento es difícil, si no imposible, en animales inmovilizados. Los primeros avances implicaron la grabación de las células Mauthner de peces nadadores atados^3,4. Sin embargo, las células Mauthner son desproporcionadamente grandes y las amplitudes potenciales de acción registradas, que pueden ir tan alto como unos pocos mV, facilitan la grabación. Más tarde, Canfield y otros describieron una prueba de concepto cuando se utiliza un animal atado para registrar el telencéfalo de los peces⁵. Otra técnica reciente para registrar la actividad neuronal de los peces es la toma de imágenes de calcio (ver comentarios de Orger y de Polavieja⁶, y Vanwalleghem et al.⁷). Esta técnica fue desarrollada para su uso con larvas de pez cebra porque la piel y el cráneo son transparentes durante la etapa larval. Sin embargo, esta técnica no se puede utilizar para estudiar comportamientos complejos en etapas posteriores de desarrollo.

Aquí, presentamos una técnica novedosa para registrar la actividad neuronal extracelular desde el cerebro de los peces que nadan libremente. Esta es una versión modificada del protocolo descrito en Vinepinsky et al.⁸. La principal innovación es la adición de un microdrive que permite controlar la posición de los electrodos después de la cirugía. La técnica está diseñada para grabar desde el telencéfalo de peces dorados utilizando un conjunto de tetrodes que están conectados a un registrador de datos neuronales a través de un micromotor. Toda la configuración es inalámbrica y anclada al cráneo del pez. El peso específico del sistema se iguala al peso específico del agua mediante la adición de un pequeño flotador que permite a los peces nadar libremente.

La técnica se basa en el uso de un registrador de datos neuronales que amplifica, digitaliza y almacena la señal en un dispositivo de memoria integrado. El sistema de telemetría del registrador se utiliza para iniciar y detener las grabaciones, y para la sincronización con la cámara de vídeo. En este protocolo, se utiliza un registrador neural de 16 canales, integrado en una caja impermeable junto con el micromotor.

El conjunto de microunidades se fabrica a partir de dos componentes principales: el propio micromotor y la carcasa de microunidad(Figura 1A,B). La carcasa sostiene el micromotor y los tetrodes, y también actúa como el ancla entre el cráneo y la caja del registrador(Figura 1C). La caja registradora de PVC se fabrica mediante un proceso de máquina y se sella mediante una red tórica(Figura 1E-G,véase también Figura suplementaria 1, Figura suplementaria 2y Figura suplementaria 3 para un diagrama tridimensional [3D]). En un extremo, un pedazo de espuma de poliestireno se une a la caja del registrador para compensar el peso del implante y proporcionar al pez un implante neutro de flotabilidad. La construcción del micromotor descrito en el protocolo sigue el procedimiento presentado por Vandecasteele et al.⁹ con una modificación para conectar el micromotor a la carcasa(Figura 1A). Se presentan todos los pasos principales.

El procedimiento descrito en el protocolo para preparar el cráneo de pescado es similar al que se presenta en Vinepinsky et al.⁸ y se describe brevemente en el protocolo. Un día después de la cirugía, los peces normalmente se recuperan completamente de los efectos de la anestesia y están listos para los experimentos conductuales. Tenga en cuenta que la ubicación del tetrode se puede ajustar girando el tornillo de micromotor. El tornillo tiene un espaciado de 300 m por rotación completa y se recomienda un avance de 75 m hasta que se alcance la ubicación del cerebro objetivo. Se debe consultar un atlas cerebral adecuado para apuntar a la región cerebral específica de interés. Es aconsejable probar la impedancia del electrodo cada vez que el pez es anestesiado para el reemplazo de la batería o la tarjeta de memoria.