Gravação eletrofisiológica sem fio dos neurônios por tetrodes móveis em peixes livremente da natação

Os peixes são o maior e mais diversificado grupo de vertebrados, e como outros vertebrados eles exibem habilidades cognitivas complexas, como navegar, socializar, dormir, caçar, etc. No entanto, os mecanismos neurais que regem o comportamento dos peixes permanecem em sua maior parte desconhecidos.

Nas últimas décadas, gravações extracelulares de peixes imobilizados foram implementadas principalmente para investigar diferentes aspectos da base neural do comportamento^1,2. Embora esta técnica seja apropriada para alguns sistemas sensoriais, a investigação de todo o espectro da base neural de comportamento é difícil, se não impossível, em animais imobilizados. Os primeiros avanços envolveram a gravação das células Mauthner de peixes de natação amarrados^3,4. No entanto, as células Mauthner são desproporcionalmente grandes e as amplitudes potenciais de ação registradas, que podem ir tão alto quanto alguns mV, facilitam a gravação. Mais tarde, Canfield et al. descreveu uma prova de conceito ao usar um animal amarrado para gravar a partir do telencefalon de^{peixes 5}. Outra técnica recente para o registro da atividade neural a partir de peixes é a imagem de cálcio (ver comentários de Orger e de Polavieja⁶, e Vanwalleghem et al.⁷). Esta técnica foi desenvolvida para uso com larvas de zebrafish porque a pele e o crânio são transparentes durante o estágio larval. No entanto, esta técnica não pode ser usada para estudar comportamentos complexos em estágios posteriores de desenvolvimento.

Aqui, apresentamos uma nova técnica para a gravação da atividade neural extracelular dos cérebros dos peixes nadadores livremente. Esta é uma versão modificada do protocolo descrito em Vinepinsky et al.⁸. A principal inovação é a adição de um microdrive que possibilita controlar a posição dos eletrodos após a cirurgia. A técnica é projetada para a gravação do telencephalon do goldfish usando um jogo dos tetrodes que são conectados a um registrador neural dos dados através de uma microdrive. Toda a configuração é sem fio e ancorada no crânio do peixe. O peso específico do sistema é igualado ao peso específico da água, adicionando um pequeno flutuador que permite que os peixes nadem livremente.

A técnica é baseada no uso de um registrador de dados neural que amplifica, digitaliza e armazena o sinal em um dispositivo de memória a bordo. O sistema de telemetria madeireiro é usado para iniciar e parar as gravações, e para sincronização com a câmera de vídeo. Neste protocolo, um madeireiro neural de 16 canais é usado, embutido em uma caixa impermeável junto com o microdrive.

A montagem de microdrive é fabricada a partir de dois componentes principais: o microdrive em si e a carcaça de microdrive (Figura 1A,B). A habitação contém o microdrive e os tetrodes, e também atua como a âncora entre o crânio ea caixa madeireiro (Figura 1C). A caixa de registrador de PVC é fabricada usando um processo de máquina e é selada usando um Anel O(Figura 1E-G, veja também figura suplementar 1, Figura Suplementar 2e Figura Suplementar 3 para um diagrama tridimensional [3D]). Em uma extremidade, um pedaço de espuma de poliestireno é anexado à caixa de cabeçudo para compensar o peso do implante e fornecer o peixe com um implante neutro em flutuabilidade. A construção do microdrive descrito no protocolo segue o procedimento apresentado por Vandecasteele et al.⁹ com uma modificação para anexar o microdrive à habitação (Figura 1A). Todos os passos principais são apresentados.

O procedimento descrito no protocolo para preparar o crânio de peixe é semelhante ao apresentado em Vinepinsky et al.⁸ e é descrito brevemente no protocolo. Um dia após a cirurgia, os peixes são normalmente totalmente recuperados dos efeitos da anestesia e estão prontos para os experimentos comportamentais. Observe que a localização do téts pode ser ajustada girando o parafuso de microdrive. O parafuso tem um espaçamento de 300 μm por rotação completa e um avanço de 75 μm é recomendado até que a localização do cérebro alvo seja atingida. Um atlas cerebral apropriado deve ser consultado para atingir a região específica do cérebro de interesse. É aconselhável testar a impedância do elétrodo cada vez que os peixes são anestesiados para a bateria ou a recolocação do cartão de memória.