הקלטה אלקטרופיסיולוגית של הנוירונים על ידי להזזה Tetrodes בחינם שחייה דגים
Summary
טכניקה אלחוטית הרומן עבור הקלטת אותות עצביים מן המוח של שחייה בחופשיות הזהב מוצג. המכשיר מורכב משני tetrodes, מיקרודרייב, לוגר מידע עצבי, ומקרה עמיד למים. כל החלקים מותאמים אישית למעט לוגר הנתונים והמחבר שלו.
Abstract
המנגנונים העצביים השולטים בהתנהגות הדג אינם ידועים בעיקר, אך הדגים מהווים את רוב החוליות. היכולת להקליט את פעילות המוח מדגים הנעים בחופשיות יקדם מחקר על בסיס עצבי של התנהגות הדג באופן משמעותי. יתרה מזאת, שליטה מדויקת במיקום ההקלטה במוח היא קריטית ללימוד פעילות עצבית מתואמת על פני אזורים במוח הדגים. כאן, אנו מציגים טכניקה הרושמת באופן אלחוטי מהמוח של דגים שוחים בחופשיות תוך שליטה על עומק מיקום ההקלטה. המערכת מבוססת על לוגר עצבי הקשורים השתל תואם מים הרומן שיכול להתאים את מיקום ההקלטה על ידי מיקרודרייב מבוקרת tetrodes. יכולות המערכת מומחשות באמצעות הקלטות מתוך הטלנצאלון של דג הזהב.
Introduction
דגים הם הקבוצה הגדולה והמגוונת ביותר של בעלי חוליות, וכמו בעלי חוליות אחרים הם מציגים יכולות קוגניטיביות מורכבות כגון ניווט, החברה, שינה, ציד ועוד. למרות זאת, המנגנונים העצביים השולטים בהתנהגות הדג נשארים לרוב לא ידועים.
בעשורים האחרונים, הקלטות ממומשות מ-“מוטפיש” בוצעו בעיקר כדי לחקור היבטים שונים של הבסיס העצבי של התנהגות1,2. למרות שטכניקה זו מתאימה לכמה מערכות חישה, החקירה של הספקטרום המלא של התנהגות עצבית היא קשה אם לא בלתי אפשרי לקיבוע בעלי חיים. ההתקדמות הראשונה מעורבת הקלטה מתאי ארגמן של דג שחייה קשור3,4. עם זאת, תאים מאותנר הם גדולים באופן לא פרופורציונלי ופעולה מוקלטת הפוטנציאל המוני, אשר יכול ללכת גבוה כמו כמה mV, להקל על ההקלטה. מאוחר יותר, Canfield ואח ‘ תיאר הוכחת רעיון בעת שימוש בחיה קשורה להקליט מתוך הטלנצאלון של הדג5. טכניקה נוספת שנעשתה לאחרונה עבור הקלטת פעילות עצבית מן הדגים הוא הדמיה סידן (ראה ביקורות של Orger ו de Polavieja6, ו Vanwalleghem ואח ‘7). טכניקה זו פותחה לשימוש עם הזחלים דג זברה כי העור והגולגולת הם שקופים בשלב זחל. עם זאת, לא ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי ללמוד התנהגויות מורכבות בשלבים מאוחרים יותר של פיתוח.
כאן, אנו מציגים טכניקה הרומן עבור הקלטת פעילות עצבית מן המוחות של דגים שוחה בחופשיות. זוהי גירסה ששונתה של הפרוטוקול המתואר ב-Vinepinsky et al.8. החדשנות העיקרית היא תוספת של מיקרודרייב שמאפשר לשלוט על מיקום האלקטרודות לאחר הניתוח. הטכניקה מיועדת להקלטה מתוך הטלנצאלון של דגי זהב באמצעות מערכת של tetrodes המחוברים לוגר מידע עצבי באמצעות מיקרודרייב. כל ההתקנה היא אלחוטית מעוגנת הגולגולת של הדג. המשקל הסגולי של המערכת מוחודש למשקל הספציפי למים על ידי הוספת מצוף קטן המאפשר לדגים לשחות בחופשיות.
הטכניקה מבוססת על השימוש לוגר מידע עצבי המעלה, digitizes, ומאחסן את האות בהתקן זיכרון על הסיפון. מערכת הטלמטריה לאוגר משמשת להפעלה ולעצירה של ההקלטות, ולסנכרון עם מצלמת הווידיאו. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש באוגר עצבי בן 16 ערוצים, המוטבע בתוך תיבה עם המיקרו-כונן.
מכלול המיקרו-כונן מפוברק משני מרכיבים עיקריים: המיקרו-כונן עצמו ומגורי המיקרו-כונן (איור 1א, ב). הדיור מחזיק במיקרו-כונן ובטטרודס, ומשמש גם כעוגן בין הגולגולת לבין תיבת האוגר (איור 1ג). התיבה לאוגר PVC מפוברק באמצעות תהליך מכונה והיא אטומה באמצעות O-ring (איור 1E-G, ראה גם איור משלים 1, איור משלים 2, ואיור משלים 3 עבור דיאגרמה תלת ממדית [3d]). בקצה אחד, פיסת קלקר מחוברת לתיבת האוגר כדי לפצות על המשקל של השתל ולספק את הדג עם שתל לציפה נייטרלי. בניית המיקרו-כונן המתואר בפרוטוקול מלווה את ההליך המוצג על ידי ואנדאקסטיל ואח ‘9 עם שינוי לחיבור המיקרו-כונן לדיור (איור 1א). כל השלבים העיקריים מוצגים.
ההליך המתואר בפרוטוקול להכין את גולגולת הדג דומה לזה שהוצגו ב Vinepinsky et al.8 והוא מתואר בקצרה בפרוטוקול. יום אחד לאחר הניתוח, הדג בדרך כלל התאושש באופן מלא מן ההשפעות של הרדמה והם מוכנים ניסויים התנהגותיים. שים לב כי ניתן לכוונן את מיקום ה-tetrode על-ידי הפיכת בורג המיקרו-כונן. בורג יש מרווח של 300 יקרומטר לסיבוב מלא וקידום 75 יקרומטר מומלץ עד מיקום המוח היעד הוא הגיע. אטלס המוח המתאים צריך להתייעץ כדי למקד את אזור המוח הספציפי של עניין. מומלץ לבדוק את העכבה אלקטרודה בכל פעם הדג מורדם עבור סוללה או החלפת כרטיס זיכרון.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מפרט את הצעדים הכרוכים בנטיעת מערך מעטפת לתוך הטלנצאלון של דגי זהב שוחים בחופשיות. טכניקה זו מיישמת לוגר עצבי כי מגביר ומתעד את האותות שנרכשו של עד 16 ערוצים יחד עם מיקרודרייב שיכול להתאים את המיקום tetrode במוח. המיקרו-כונן מאפשר לכוונן את המיקום במוח כדי למטב את ההקלטה.
<p class="jove_…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה לנחום אולנובסקי ולחברי מעבדת אולאנקובסקי על כל עזרתם. בנוסף, אנו אסירי תודה לטל נובאופנסקי-צור לקבלת סיוע טכני מועיל. אנו מכירים בהכרת המדינה את התמיכה הפיננסית בקרן המדע הישראלית-התוכנית הראשונה (מענק מס ‘ 281/15), וקרן הנאמנות ההלמסלי דרך היוזמה החקלאית, הביולוגית והקוגניטיבית של אוניברסיטת בן-גוריון בנגב.
Materials
| 0.7 mm round drill bits | Compatible with the drill. | ||
| 15-blade Scalpel | Sigma-Aldrich | ||
| 16 channel PCB board | Neurlynx | EIB-16 | |
| 1X3M phillips flat head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 1X3M phillips round head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 27 cm X 19 cm X 1 mm brass plate | See Figure 2 | ||
| 2X6M phillips flat head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 3140 RTV coating | Dow Crowning | 2767996 | |
| 75 µm Silver wire | A-M Systems | ||
| Brass machine screws #00-90 | 947-1006 | ||
| Brass plates 7.5mm X 2.5mm X 0.6mm | A 3D drawing is provided. See supplementary 1 | ||
| Coated Tungsten wire 25µm | California Fine Wire Company | 5000160 | Depending on the appication the tetrodes can be fabricated from any type of wire. Popular wires are nicrome wires that can be found with lower diameters (eg. A-M systems, 762000) |
| Coated Tungsten wire 50µm | A-M Systems | 795500 | Can be replaced with any other wire with low impedance |
| Cyanoacrilic glue | |||
| Dental Burnisher | ComDent UK | Any small sterille stainless-still tool will do. | |
| Dental cement – GCFujiPLUS | GC | 431011 | Other dental cements would probably will work as well although we have never tried any other. |
| Dental drill or nail polish drill | Dental drills are expensive, a nail polish drill can be a cheap replacement. | ||
| Drill bit #65 | 947-65 | ||
| Fast curing epoxy | Any 5 minutes curing epoxy can be used here. | ||
| Logger box with O-ring sealing | A 3D drawing is provided. See supplementary 1-3. The box should be machine fabricated (do not use 3D printers). Use transperant material, to be able to see the indicator LEDs on the logger. | ||
| Motorized turning device | Custom made as described in "open ephys" website. Can also be purchusaed from neurolynx ("Tetrode Spinner 2.0") or bulit by other means. | ||
| Mouselog-16 Neural logger | Deuteron Technologies Ltd | There are several neural loggers available on the market, including: SpikeGadget (UH32 32channels) and Neurologger 2/2A/2B of Alexei Vyssotski. It should be noted that weight is not a major contraint since it can be counterbalanced with floating Styrofoam | |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | Ethtl 3-aminobenzoate methanesulfonate 98% |
| Nano-Z plating | White Matter LLC | The nano-Z can be bought from several supllieres. Any impedance meter can be used, e.g. IMP-1 / 6662 / 2788, BAK Electronics. | |
| PCB pins | Neurlynx | Neuralynx EIB Pins | |
| Polymide tubing 250µm | A-M Systems | 822000 | |
| Rechargable battery | 3.7 Lipo battery, 370 mAh. Holds about 6 hours of recording. Smaller or larger battries can be used to reduce the weight or extend recording time. | ||
| Silicone tubing 0.64 mm | A-M Systems | 806100 | |
| Stainless steel 1.5 mm | A-M Systems | 846000 | |
| Sudium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Tap #00-90 | 947-1301 | ||
| Vaseline | Any type of soft petroleum skin protectant can be used here. |
References
- Jacobson, M., Gaze, R. M. Types of visual response from single units in the optic tectum and optic nerve of the goldfish. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 49 (2), 199-209 (1964).
- Ben-Tov, M., Donchin, O., Ben-Shahar, O., Segev, R. Pop-out in visual search of moving targets in the archer fish. Nature Communications. 6, 6476 (2015).
- Zottoli, S. J. Correlation of the startle reflex and Mauthner cell auditory responses in unrestrained goldfish. Journal of Experimental Biology. 66 (1), 243-254 (1977).
- Canfield, J. G., Rose, G. J. Activation of Mauthner neurons during prey capture. Journal of Comparative Physiology A. 172 (5), 611-618 (1993).
- Canfield, J. G., Mizumori, S. J. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. Journal of Neuroscience Methods. 133 (1-2), 127-134 (2004).
- Orger, M. B., de Polavieja, G. G. Zebrafish behavior: opportunities and challenges. Annual Review of Neuroscience. 40, 125-147 (2017).
- Vanwalleghem, G. C., Ahrens, M. B., Scott, E. K. Integrative whole-brain neuroscience in larval zebrafish. Current Opinion in Neurobiology. 50, 136-145 (2018).
- Vinepinsky, E., Donchin, O., Segev, R. Wireless electrophysiology of the brain of freely swimming goldfish. Journal of Neuroscience Methods. 278, 76-86 (2017).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (61), e3568 (2012).
- Ferguson, J. E., Boldt, C., Redish, A. D. Creating low-impedance tetrodes by electroplating with additives. Sensors and Actuators A: Physical. 156 (2), 388-393 (2009).
- Arcot Desai, S., Rolston, J. D., Guo, L., Potter, S. M. Improving impedance of implantable microwire multi-electrode arrays by ultrasonic electroplating of durable platinum black. Frontiers in Neuroengineering. 3, 5 (2010).
- Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network: Computation in Neural Systems. 9 (4), R53-R78 (1998).
- Teixeira, F. B., Freitas, P., Pessoa, L. M., Campos, R. L., Ricardo, M. Evaluation of IEEE 802.11 underwater networks operating at 700 MHz, 2.4 GHz and 5 GHz. Proceedings of the 10th International Conference on Underwater Networks & Systems. , (2015).
- Sendra, S., Lloret, J., Rodrigues, J. J., Aguiar, J. M. Underwater wireless communications in freshwater at 2.4 GHz. IEEE Communications Letters. 17 (9), 1794-1797 (2013).
- Lloret, J., Sendra, S., Ardid, M., Rodrigues, J. J. Underwater wireless sensor communications in the 2.4 GHz ISM frequency band. Sensors. 12 (4), 4237-4264 (2012).
- Hoogerwerf, A. C., Wise, K. D. A three-dimensional microelectrode array for chronic neural recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 41 (12), 1136-1146 (1994).
- Harris, K. D., Quiroga, R. Q., Freeman, J., Smith, S. L. Improving data quality in neuronal population recordings. Nature Neuroscience. 19 (9), 1165 (2016).
